Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם
Summary
עד לאחרונה, מחקרים ביטוי על המוח האנושי היו מוגבלים כימות של RNA או חלבון. בעזרת טכניקות immunoprecipitation הכרומטין המתואר במאמר זה, ניתן יהיה למפות מתילציה היסטון ורגולטורים אחרים epigenetic של ביטוי גנים במוח שלאחר המוות.
Abstract
מחלות נוירו כרונית כגון סכיזופרניה, מחלה דו קוטבית אוטיזם נחשבים כתוצאה משילוב של גורמים גנטיים וסביבתיים שעשויים לגרום לשינויים epigenetic של ביטוי גנים לפתולוגיה מולקולרית אחרים. באופן מסורתי, עם זאת, מחקרים ביטוי במוח שלאחר המוות הוגבלו כימות mRNA או חלבון. המגבלות נתקל במחקר שלאחר המוות המוח כגון variabilities בזמן autolysis ו integrities רקמות עשויים גם להשפיע מחקרים של מבנים גבוהים על מנת הכרומטין. עם זאת, הארגון nucleosomal של הדנ"א הגנומי כולל ה-DNA: ליבה היסטון מחייב – נראה להישמר בעיקר מדגמים מייצגים הניתנים על ידי בנקים שונים במוח. לפיכך, ניתן ללמוד את דפוס מתילציה ושינויים קוולנטיים אחרים של ההיסטונים הליבה לוקוסים הגנומי מוגדרים במוח שלאחר המוות. כאן, אנו מציגים פשוטה יליד הכרומטין immunoprecipitation (NChIP) פרוטוקול קפוא (לא קבועה) דגימות מוח אנושי. החל העיכול nuclease micrococcal homogenates של המוח, בעקבות NChIP ידי qPCR ניתן להשלים בתוך שלושה ימים. המתודולוגיה המוצגת כאן צריך להיות שימושי להבהיר מנגנוני epigenetic של ביטוי גנים במוח אנושיים בריאים וחולים.
Protocol
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן הוא שימושי במיוחד עבור החוקרים מעוניינים חתימות מתילציה היסטון ו / או ה-DNA של המוח האנושי, כי אלה סימנים הכרומטין ניתן נוטה פחות חפצים הנתיחה שלאחר המוות לעומת סוגים אחרים של שינויים, כולל acetylation (היסטון) ו זירחון 1, 2. המוח הנתיחה ניתנת ללימוד מונו nucleosomal …
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות הנפש (5R01MH071476).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
| Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
| Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
| Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
| 3M DTT | Fluka | 43815 | ||
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
| Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions:
- nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
- 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
- Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
- High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
- Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
- TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
- Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
- Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
- 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
References
- Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 .
- Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 .
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 .
- Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 .
- Huang, H. u. a. n. g., Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, .
- Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 .
