Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano
Summary
Até recentemente, estudos de expressão no cérebro humano eram limitados a quantificação de RNA ou proteína. Com as técnicas de imunoprecipitação de cromatina descritas neste documento, será possível mapear a metilação da histona e outros reguladores epigenética da expressão gênica no cérebro pós-morte.
Abstract
Crônica doenças neuropsiquiátricas como a esquizofrenia, doença bipolar e autismo são pensados para resultar de uma combinação de fatores genéticos e ambientais que podem resultar em alterações epigenéticas da expressão gênica e outra patologia molecular. Tradicionalmente, no entanto, estudos de expressão no cérebro pós-morte foram confinados a quantificação de mRNA ou da proteína. As limitações encontradas na investigação pós-morte do cérebro, como variabilidades no tempo autólise e integridades tecidos também são susceptíveis de impacto a todos os estudos de estruturas de maior cromatina ordem. No entanto, a organização nucleosomal de DNA genômico, incluindo DNA: núcleo da histona vinculativo – parece ser em grande parte preservados em amostras representativas prestados pelos bancos cérebro diferentes. Portanto, é possível estudar o padrão de metilação e outras modificações covalentes das histonas no núcleo definido loci genômicos no cérebro pós-morte. Aqui, apresentamos uma versão simplificada nativa imunoprecipitação da cromatina protocolo (NChIP) para amostras congeladas (nunca fixo) cérebro humano. Começando com micrococcal digestão nuclease de homogeneizados de cérebro, NChIP seguido por qPCR pode ser concluída dentro de três dias. A metodologia apresentada aqui deve ser útil para elucidar os mecanismos epigenéticos de expressão gênica em normais e doentes cérebro humano.
Protocol
Discussion
O protocolo apresentado aqui é particularmente útil para os pesquisadores interessados em assinaturas de metilação das histonas e / ou DNA do cérebro humano, porque essas marcas cromatina pode ser menos propenso a artefatos pós-morte, em comparação com outros tipos de modificações, incluindo (histonas) acetilação e fosforilação 1, 2. O cérebro pós-morte é passível de estudo da mono-nucleosomal preparados; o DNA permanece em grande parte ligado à histonas do núcleo, pelo menos em amostras com intervalos d…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde Mental (5R01MH071476).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
| Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
| Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
| Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
| 3M DTT | Fluka | 43815 | ||
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
| Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions:
- nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
- 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
- Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
- High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
- Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
- TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
- Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
- Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
- 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
References
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