Хроматин Пробирной по правам ткани мозга
Summary
До недавнего времени выражение исследования человеческого мозга были ограничены количественного РНК или белка. С хроматин иммунопреципитации методы описаны в этой статье, можно будет сопоставить гистонов метилирование и других эпигенетических регуляторов экспрессии генов в посмертных мозг.
Abstract
Хронический психоневрологических заболеваний, таких как шизофрения, биполярное заболевание и аутизмом, как полагают, является результатом сочетания генетических и экологических факторов, которые могут привести к эпигенетических изменений экспрессии генов и других молекулярных патологии. Традиционно, однако, выражение исследований в посмертных мозга были приурочены к количественной оценке мРНК или белка. Ограничения встречаются в посмертных исследований мозга, такие как изменчивость в аутолиза времени и ткани целостностей также возможных последствий любого исследования высшей структуры хроматина порядке. Тем не менее, нуклеосомной организации геномной ДНК, включая ДНК: основные гистонов обязательным – как представляется, в значительной степени сохранились в репрезентативных выборок, предоставляемых различными банками мозга. Таким образом, можно изучать метилирования и другие ковалентные модификации гистонов ядро в определенные геномных локусов в посмертных мозг. Здесь мы приведем упрощенную родной хроматин иммунопреципитации (NChIP) протокол для замороженных (никогда не фиксированной) образцы человеческого мозга. Начиная с микрококковой нуклеазы пищеварения мозга гомогенатов NChIP следуют КПЦР может быть завершена в течение трех дней. Методология, представленная здесь, должно быть полезным для выяснения эпигенетические механизмы экспрессии генов в нормальных и больных человеческого мозга.
Protocol
Discussion
Протокол изложенных здесь особенно полезен для следователей интересует гистонов и / или метилирования ДНК подписей человеческого мозга, потому что эти хроматина маркировка может быть менее склонными к посмертной артефакты по сравнению с другими типами модификаций, в том числе (гистонов) ацетили…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального института психического здоровья (5R01MH071476).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
| Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
| Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
| Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
| 3M DTT | Fluka | 43815 | ||
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
| Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions:
- nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
- 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
- Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
- High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
- Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
- TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
- Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
- Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
- 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
References
- Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 .
- Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 .
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 .
- Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 .
- Huang, H. u. a. n. g., Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, .
- Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 .
