Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano
Summary
Hasta hace poco, los estudios de expresión en el cerebro humano se limita a la cuantificación de ARN o de proteína. Con las técnicas de inmunoprecipitación de cromatina se describe en este artículo, será posible asignar metilación de las histonas y otros reguladores epigenética de la expresión génica en el cerebro postmortem.
Abstract
Enfermedades neuropsiquiátricas crónicas como la esquizofrenia, enfermedad bipolar y el autismo se cree que el resultado de una combinación de factores genéticos y ambientales que podrían resultar en alteraciones epigenéticas de la expresión génica y otras patología molecular. Tradicionalmente, sin embargo, los estudios de expresión en el cerebro post mortem se limitaron a la cuantificación de ARNm o proteína. Las limitaciones encontradas en la investigación postmortem del cerebro tales como variabilidad en el tiempo y la autolisis integridades tejido también es probable que el impacto de los estudios de estructuras de orden superior de la cromatina. Sin embargo, la organización nucleosomal de ADN genómico como el ADN: núcleo de unión de histonas – parece ser preservado en gran medida en muestras representativas de los bancos diferentes del cerebro. Por lo tanto, es posible estudiar el patrón de metilación y otras modificaciones covalentes de las histonas en definir loci del genoma en el cerebro postmortem. A continuación, presentamos una versión simplificada nativos inmunoprecipitación de cromatina (NChIP) protocolo para muestras de cerebro congelado (no fijos) humanos. A partir de la digestión nucleasa micrococcal de homogeneizados de cerebro, NChIP seguido por qPCR se puede completar en tres días. La metodología que aquí se presenta debe ser útil para dilucidar los mecanismos epigenéticos de la expresión génica en el cerebro humano normal y enfermo.
Protocol
Discussion
El protocolo descrito aquí es particularmente útil para los investigadores interesados en las firmas de metilación de las histonas y / o ADN del cerebro humano, ya que estas marcas de la cromatina puede ser menos propensa a los artefactos post-mortem, en comparación con otros tipos de modificaciones, incluyendo (histonas) acetilación y fosforilación 1, 2. El cerebro postmortem se presta al estudio de la mono-nucleosomal los preparativos, el ADN permanece en gran parte unido a las histonas centrales, al menos en las mu…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Salud Mental (5R01MH071476).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
| Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
| Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
| Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
| 3M DTT | Fluka | 43815 | ||
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
| Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions:
- nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
- 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
- Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
- High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
- Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
- TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
- Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
- Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
- 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
References
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