En kromatin-analys för mänskliga hjärnvävnaden
Summary
Fram till nyligen var uttryck studier på mänskliga hjärnan begränsad till kvantifiering av RNA eller protein. Med kromatin immunoprecipitation tekniker som beskrivs i detta dokument kommer det att vara möjligt att kartlägga histon metylering och andra epigenetiska regulatorer av genuttryck i döden hjärnan.
Abstract
Kroniska neuropsykiatriska sjukdomar som schizofreni, bipolär sjukdom och autism tros bero på en kombination av genetiska och miljömässiga faktorer som kan leda till epigenetiska förändringar av genuttryck och andra molekylär patologi. Traditionellt var dock uttryck studier i döden hjärnan begränsad till kvantifiering av mRNA eller protein. Begränsningarna stött på döden hjärnforskning som variabilitet i autolys tid och integrities vävnad är också sannolikt att påverka några studier av högre strukturer för kromatin. Men nucleosomal organisation av arvsmassans DNA inklusive DNA: core histon bindande – verkar vara i stort sett bevaras i representativa prover som tillhandahålls av olika hjärnan banker. Därför är det möjligt att studera metylering mönstret och andra kovalenta modifieringar av kärnan histoner vid definierade genetiska loci i döden hjärnan. Här presenterar vi en förenklad infödd kromatin immunoprecipitation (NChIP) protokoll för frysta (aldrig fast) mänskliga hjärnan exemplar. Från och med micrococcal nukleas rötning av hjärnan homogenat, följt NChIP av qPCR kan slutföras inom tre dagar. Den metod som presenteras här bör vara användbar för att belysa epigenetiska mekanismer av genuttryck i normala och sjuka mänskliga hjärnan.
Protocol
Discussion
Det protokoll som beskrivs här är särskilt användbart för utredarna intresserade histon och / eller DNA-metylering underskrifter mänskliga hjärnan, eftersom dessa kromatin märken kan vara mindre benägna att obduktion artefakter jämfört med andra typer av förändringar, inklusive (histon) acetylering och fosforylering 1, 2. Den obduktion hjärnan är mottaglig för studiet av mono-nucleosomal preparat; DNA är i stort sett knutna till kärnan histoner, åtminstone i prover med representativa autolys intervall (tiden me…
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institute of Mental Health (5R01MH071476).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
| Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
| Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
| Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
| 3M DTT | Fluka | 43815 | ||
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
| Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions:
- nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
- 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
- Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
- High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
- Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
- TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
- Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
- Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
- 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
References
- Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 .
- Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 .
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 .
- Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 .
- Huang, H. u. a. n. g., Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, .
- Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 .
