Summary
本视频演示了新的文化,鸡胚培养24小时以外的鸡蛋的方法。这种方法使研究的早期发展(原始连胜,以14索姆),鼠标E7 - 9对应一个时期。这项技术的应用,包括电,原位杂交和免疫组化。
Abstract
鸡胚是一个有价值的工具,在早期胚胎发育的研究。其透明度,可获得性和易于操纵,它为研究大脑,神经管,体节和心脏原基的形成和图案的理想工具。鸡胚培养的应用包括电的DNA或RNA的结构,以原位杂交和免疫组织化学分析基因的功能,生长因子,如涂珠FGFs和BMPs的移植,以及整装。本视频演示了在鸡胚培养的不同步骤,首先,胚胎是在生理盐水explanted。然后,胚胎中心的玻璃环上。周围的胚胎膜沿环的墙壁被取消。环,然后放置在文化菜含有白蛋白池。是密封的培养皿中,并放置在潮湿的腔,胚胎培养24小时。最后,胚胎是从环中删除,固定,并为进一步的应用处理。还介绍了故障排除指南。
Protocol
第1部分:台成立
- 一股潮湿室是放置在塑料商会Kimwipe / DDH 2 O的准备。
- 一个猎鹰管收集白蛋白,文化,戒指,表面玻璃和废物处置的菜都放在替补席上。
- 耐热盘充满生理盐水1.4升(见注释[A])。
第2部分:胚胎在盐水explanted
- 鸡蛋是从孵化器中删除后16小时(第4阶段)。鸡蛋是由攻壳钳opene。壳牌件被删除。
- 薄白蛋白收集猎鹰管。厚厚的白蛋白是用镊子除去。
- 胚胎被放置在一个塑料盘内的盐水菜。剩下的白蛋白是用镊子除去。
第3部分:环中心的胚胎
- 卵黄囊是用镊子倾斜,使胚胎朝上。
- 卵黄囊是在赤道或以下程度的削减。
- 卵黄膜是用细镊子,迅速去皮。卵黄膜为导向,因此,其颗粒的一面(非光亮)朝上。
- 用细镊子,卵黄膜置于手表玻璃上。
- 用细镊子,玻璃环适用于卵黄膜的顶部,并为中心的胚胎。
- 卵黄膜是解除了周围的玻璃环的边缘。大会是从盐水菜。
第4部分:文化是设置在显微镜下
- 卵黄膜是使用显微镜下细的镊子在玻璃环解除。
- 使用巴斯德吸管,生理盐水从环的外缘。
- 用细剪刀,多余的卵黄膜是从玻璃环的内侧边缘。护理是采取不刺破膜用吸管或镊子。
- 胚胎是轻轻地用生理盐水冲洗,去除松散的膜和卵黄细胞。
- 200μL生理盐水添加到外缘环(这将有利于以后转让)。
- 大会是覆盖着一个倒置的塑料盘。
第5部分:文化是转移到孵化器
- 一个标记为“猎鹰培养皿。
- 薄血白蛋白2.5毫升添加到猎鹰培养皿的底部。
- 200μL薄血白蛋白被添加到猎鹰培养皿的盖子内缘。
- 倒菜是从大会。
- 用细镊子,玻璃环下滑沿表玻璃的边缘,并转移到猎鹰菜。
- 所有剩余的生理盐水是从环的内表面。
- 猎鹰盘盖与盖和密封。
- 大会是放置在潮湿的腔,然后在孵化器。
- 胚胎培养24小时,在38 ° C
第6部分:文化之后,胚胎是固定的,文化是转移到孵化器
- 如果胚胎是要处理的原位杂交),一个固定的菜充满了冰冷的PBS(或DEPC - PBS。
- 文化是从孵化器中删除,并立即置于冰上。立即充满了冰冷的PBS / DEPC - PBS的培养皿。
- 胚胎从卵黄膜分离。胚胎转移到固定的菜,用巴斯德吸管的钝端。
- 胚胎是使用罚款钳钝端牵制。 PBS覆盖固定盘被删除。固色剂添加(见注[B])。
- 根据应用,胚胎是固定的6-8小时,在4 °℃(恒温器),O / N在4 ° C(所在地),或在室温下1小时整装免疫组织化学
- 固定液用冰冷的PBS / DEPC PBS拆除和更换。
- 对于下游应用原位杂交或immantibody染色,如:神经系统和心脏穿孔使用钝年底microcapillary针或显微切割刀,这将防止探头/抗体被困在后面的步骤。
注释 :[A]盐水解决方案包括:(1升):121.0 g氯化钠,氯化钾15.5克,10.4克氯化钙2 .2 H 2 O,12.7克氯化镁2 .6 H 2 O; B液(1升) :2.4克钠2 HPO 4 .2 H 2 O,0.2克的NaH 2 PO 4 .2 H 2 O;高压灭菌器,在使用之前,混合120毫升与2700毫升H 2 O,加入180毫升乙混合[1]; [B]定影液是在使用前准备(4%PFA在所在地的PBS或DEPC - PBS)。
第7部分:代表结果
文化之前,胚胎是在原始连胜阶段(HH4)。在文化时期的结束,胚胎发展到HH10(长2-3毫米),在培养皿的中心可见。标签carbocyanine荧光DII一组单元格,它是可能的前文化(0H),并按照他们的运动,在整个文化时期。在这种情况下,恒胜的节点(HN)以下细胞标记与DII。这些细胞被证明有助于逐步发展的体节(SOM)和脊索(N)。
第8部分:故障排除
问题 | 原因 | 补救 |
---|---|---|
胚胎仍然与蛋黄,而不是膜(步骤2) | 卵子质量不佳 | 要求新鲜鸡蛋;在收到商店鸡蛋在13 ° C。孵育鸡蛋为入住日期的当天。 |
卵黄膜滑离钟表匠的玻璃环以下的位置(步骤3) | 白蛋白残余 | 在第2步,确保所有白蛋白是从膜拉离倾斜钳移除 |
胚胎是人迹罕至:位于下方的膜(步骤4) | 膜错误的一边向上 | 在第3步,确保含有蛋黄颗粒膜的一侧朝上。的光泽,抛光的一面应朝下。 |
淹没在盐水/白蛋白以下文化的胚胎(步骤6) | 盐水/白蛋白文化前内环左;在膜孔 | 在第5步,确保所有白蛋白/生理盐水是从戒指内删除;在第4步,确保你不膜(使用钝结束钳钳皮尔斯) |
胚胎解体以下文化 | 细菌感染 | 消毒所有的工具和玻璃器皿;使用抗生素/ antimycotic |
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Discussion
一个广泛的应用,从增长因素含珠 3,整个装载在原位杂交和整装免疫组织化学 4移植,可用于新的培养方法2。超过24小时期间的文化,使胚胎发育的连续监测中的应用,如时间的推移细胞运动分析5或绿色荧光蛋白含有电穿孔结构6监测。
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Acknowledgments
这项工作是支持的玛格丽特M. Alkek基金会RHF。
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
Pyrex dish (2) | Tool | |||
Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A.
The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924). - New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).