Étiquetage sélective des protéines de surface cellulaire utilisant CyDye DIGE Fluor Colorants Minimal
Summary
Une méthode simple et spécifique a été démontrée pour le marquage fluorescent et une meilleure détection des protéines de surface cellulaire sans une étape de fractionnement. L'abondance différentielle des protéines de surface cellulaire a été analysée par électrophorèse bidimensionnelle (2-D) et Ettan ™ technologie DIGE.
Abstract
Protéines de surface sont au cœur de la capacité des cellules à réagir à son environnement et d'interagir avec les cellules voisines. Ils sont connus pour être des inducteurs de la quasi-totalité de signalisation intracellulaire. De plus, ils jouent un rôle important dans l'adaptation de l'environnement et le traitement médicamenteux, et sont souvent impliqués dans la pathogenèse de la maladie et de la pathologie (1). Interactions protéine-protéine sont intrinsèques à des voies de signalisation, et de gagner plus de perspicacité dans ces processus biologiques complexes, des méthodes sensibles et fiables sont nécessaires pour étudier les protéines de surface cellulaire. Deux dimensions (2-D) électrophorèse est largement utilisé pour la détection de biomarqueurs et d'autres cibles dans les échantillons de protéines complexes pour étudier l'évolution différentielle. Protéines de surface cellulaire, en partie en raison de leur faible abondance (1 à 2% des protéines cellulaires), sont difficiles à détecter dans un gel 2-D sans fractionnement ou un autre type d'enrichissement. Ils sont aussi souvent mal représentés dans les gels 2-D en raison de leur caractère hydrophobe et de haut poids moléculaire (2). Dans cette étude, nous présentons un nouveau protocole pour les cellules intactes en utilisant des teintures CyDye DIGE Fluor minimale pour un étiquetage spécifique et la détection de cet important groupe de protéines. Les résultats ont montré un étiquetage spécifique d'un grand nombre de protéines de surface cellulaire avec un étiquetage minimum de protéines intracellulaires. Ce protocole est rapide, simple à utiliser, et tous les trois colorants CyDye DIGE Fluor minimes (Cy 2, 3 et Cy Cy 5) peut être utilisé pour étiqueter protéines de surface cellulaire. Ces caractéristiques permettent de multiplexage en utilisant le 2-D électrophorèse de gel de fluorescence Différence (2-D DIGE) avec Ettan DIGE technologie et l'analyse des changements d'expression de protéines en utilisant DeCyder 2-D Logiciel d'analyse différentielle. Le niveau de protéines de surface cellulaire a été suivi pendant la famine de sérum de cellules CHO pour des durées différentes (voir tableau 1). De petits changements dans l'abondance ont été détectés avec une grande précision, et les résultats sont pris en charge par des méthodes statistiques définies.
Protocol
Discussion
La concentration en protéines
Un aperçu des deux flux d'étiquetage est montré dans la figure 1. Puisque les cellules sont encore intactes lorsque étiquetés selon le protocole de surface cellulaire de protéines étiquetage, seules les protéines de surface cellulaire sont exposés à la teinture. Dans le protocole standard Ettan DIGE, les cellules sont lysées avant l'étiquetage et les protéines à l'intérieur comme à l'extérieur de la cellule sont étiquetés (Fig 1…
Acknowledgements
Nous remercions le Professeur Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer et Sigurd Krieger à l'Institut de pathologie clinique, Université de Vienne, en Autriche, pour leur collaboration.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- . Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- . DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- . 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- . CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- . Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
