सेल सतह प्रोटीन CyDye DIGE Fluor मिनिमल रंगों का उपयोग कर के चयनात्मक लेबलिंग
Summary
एक सरल और विशिष्ट विधि फ्लोरोसेंट लेबलिंग और fractionation कदम बिना कोशिका की सतह प्रोटीन का बढ़ाया पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया गया. कोशिका की सतह प्रोटीन में विभेदकों बहुतायत दो आयामी वैद्युतकणसंचलन (2 डी) और Ettan ™ DIGE प्रौद्योगिकी का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था.
Abstract
भूतल प्रोटीन सेल अपने पर्यावरण के लिए प्रतिक्रिया और पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की क्षमता के लिए केंद्रीय हैं. वे लगभग सभी intracellular संकेत के inducers हो जाना जाता है. इसके अलावा, वे पर्यावरण अनुकूलन और नशीली दवाओं के उपचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और अक्सर रोग के रोगजनन और विकृति (1) में शामिल हैं. प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के संकेत दे रास्ते के लिए आंतरिक हैं, और इन जटिल जैविक प्रक्रियाओं में और अधिक जानकारी प्राप्त कोशिका की सतह प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए, संवेदनशील और विश्वसनीय तरीके की जरूरत है. दो आयामी वैद्युतकणसंचलन (2 डी) बड़े पैमाने पर बायोमार्कर और जटिल प्रोटीन के नमूने में अन्य लक्ष्यों का पता लगाने के अंतर परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए के लिए प्रयोग किया जाता है. सेल सतह प्रोटीन, आंशिक रूप से उनके कम बहुतायत (1 सेलुलर प्रोटीन के 2%) के कारण, fractionation या कुछ अन्य प्रकार के संवर्धन के बिना एक 2 – डी जेल में पता लगाने के लिए मुश्किल हैं. उन्होंने यह भी अक्सर खराब कर रहे हैं 2-D जैल उनके hydrophobic प्रकृति और उच्च आण्विक वजन (2) के कारण में प्रतिनिधित्व. इस अध्ययन में, हम बरकरार विशिष्ट और प्रोटीन के इस महत्वपूर्ण समूह की लेबलिंग का पता लगाने के लिए CyDye DIGE Fluor न्यूनतम रंगों का उपयोग कोशिकाओं के लिए एक नए प्रोटोकॉल उपस्थित थे. परिणाम intracellular प्रोटीन की न्यूनतम लेबलिंग के साथ एक कोशिका की सतह प्रोटीन की एक बड़ी संख्या में विशिष्ट लेबलिंग दिखाया. यह प्रोटोकॉल, तेजी से उपयोग करने के लिए सरल है, और सभी तीन CyDye DIGE Fluor न्यूनतम रंजक (2 Cy, 3 Cy और Cy 5) के लिए सेल सतह प्रोटीन लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन सुविधाओं Ettan DIGE और प्रोटीन अभिव्यक्ति 2 – डी DeCyder विभेदकों विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिवर्तन की प्रौद्योगिकी और विश्लेषण के साथ 2-D प्रतिदीप्ति अंतर जेल वैद्युतकणसंचलन (2 डी DIGE) का उपयोग कर बहुसंकेतन के लिए अनुमति देते हैं. सेल सतह प्रोटीन के स्तर के बाद समय के विभिन्न लंबाई के लिए चो कोशिकाओं (देखें तालिका 1) के सीरम भुखमरी के दौरान किया गया था. बहुतायत में छोटे परिवर्तन उच्च सटीकता के साथ पाया गया है, और परिणाम को परिभाषित सांख्यिकीय तरीकों द्वारा समर्थित किया गया है.
Protocol
Discussion
प्रोटीन एकाग्रता
दो लेबलिंग workflows की एक सिंहावलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है. चूंकि कोशिकाओं को अभी भी बरकरार हैं जब सेल सतह प्रोटीन लेबलिंग प्रोटोकॉल के अनुसार लेबल, केवल कोशिका की सतह प्रोटी?…
Acknowledgements
हम उनके सहयोग के लिए क्लीनिकल पैथोलॉजी, ऑस्ट्रिया, वियना विश्वविद्यालय के संस्थान में प्रोफेसर Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer और Sigurd क्रीगर धन्यवाद.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- . Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- . DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- . 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- . CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- . Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
