Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

A imagem de células vivas é particularmente útil ao estudar a dinâmica do tráfego orgânico. Este vídeo destacará um procedimento usado para obter imagens de núcleos densos em neurônios do hipocampo cultivados. Os complexos de transfecção são obtidos pela primeira vez pela mistura do meio D-N-A-M-E-M e do reagente de transfecção de lipectomia.

Como os neurônios do hipocampo são cultivados em lamínulas invertidas voltadas para uma monocamada glial, essas lamínulas devem ser viradas para expô-las ao reagente de transfecção. Depois de permitir tempo suficiente para a expressão de proteínas viscais de núcleo denso da marca GFP, uma câmara de imagem é construída. Uma imagem de ICALs de núcleo denso em neurônios cultivados pode ser realizada usando microscopia de fluorescência de campo amplo.

Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para obter imagens de outras organelas, como mitocôndrias, endossomos e peroxissomos. Olá, sou Michael Silverman e bem-vindo ao meu laboratório de neurociência celular na Simon Fraser University. Estamos interessados em como as organelas se movem nas células nervosas.

Para abordar essa questão, rotulamos organelas de membrana, especificamente vesículas centrais densas em neurônios do hipocampo cultivados. E para mostrar como fazemos isso, vou passar a palavra para David. Olá, sou David do laboratório Silverman.

Hoje vou mostrar a vocês um procedimento para imagens de células vivas de vesículas de núcleo denso e neurônios cultivados usando microscopia ocidental de campo amplo. Vamos começar. Para a maioria dos experimentos, usamos placas de neurônios do hipocampo de ratos que foram cultivadas com uma densidade celular de 250.000 células por placa de seis centímetros para cada transfecção marcada com dois tubos de 1,5 mililitro, um para o plasmídeo, DNA e outro para o reagente de transfecção.

Em uma capela de fluxo laminar, para combinar um micrograma de DNA de plasmídeo com cem microlitros de MEM em um único tubo à temperatura ambiente, certifique-se de usar MEM que não contenha suplementos. Combine seis microlitros de lábio com cem microlitros de MEM no outro tubo. A mesma quantidade pode ser usada para transfecto duplo, mesmo que a proporção de DNA labial seja reduzida pela metade nesses casos.

Para preservar a vida útil do reagente labial, mantenha-o refrigerado ou em um refrigerador de bancada o tempo todo, incube os tubos por cinco minutos em temperatura ambiente. Transfira a mistura de DNA em MEM para o tubo lipídico e misture suavemente com APE Next incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Após 25 minutos, adicione 60 microlitros de ácido neurônico K 50 milimolar para minimizar os danos citotóxicos aos neurônios cultivados.

Como cultivamos neurônios na parte inferior de lamínulas suspensas acima de uma monocamada GL, é necessário inverter as lamínulas e expor os neurônios à solução de transfecção. Vire cuidadosamente a tampa, deslize os pés para cima usando uma pinça estéril. Organize-os de forma que não se sobreponham.

Tenha cuidado para não raspar a superfície revestida de neurônios da lamínula ou a superfície revestida de ggl do prato. No final da incubação de 30 minutos, pegue aproximadamente N 0,5 mililitros de meio do prato de seis centímetros e misture suavemente com o DNA no tubo. Transfira a solução de DNA de volta para o prato, pingando uniformemente na superfície do meio.

Deslize suavemente o prato para frente e para trás em uma direção, mas certifique-se de não inchar o meio. Depois de misturar em uma direção, pare e repita na direção perpendicular para distribuir uniformemente os complexos de lipectomia de DNA por todo o prato. Incube por 90 minutos na incubadora de cultura de tecidos a 37 graus C e 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação, vire as lamínulas com os pés voltados para baixo e arrume-as de forma que não se sobreponham. Finalmente, permita que a expressão do DNA prossiga pelo tempo desejado, que normalmente é durante a noite até 48 horas na incubadora. A imagem ao vivo de células de núcleo denso marcadas com GFP em neurônios do hipocampo cultivados requer um microscópio fluorescente equipado com uma câmera CCD.

Será necessária uma câmara de imagem com um controlador de temperatura e um aquecedor objetivo. A câmara não deve conter portas abertas, uma modificação que pode ser incluída ao solicitar a câmara. Em seguida, inicie a câmera do microscópio, a lâmpada fluorescente e o software de aquisição de imagem.

Ligue a energia da plataforma da câmara e dos aquecedores objetivos. Este também é um bom momento para aplicar uma gota de óleo nos objetivos. Agora prepare a plataforma aquecida e a câmara de imagem.

Para facilitar a manipulação. Rotule um lado da parte superior da câmara com um marcador permanente. Coloque a parte superior da câmara voltada para cima na tampa de um tubo de 50 mililitros, que é um suporte de câmara ideal.

Aplique um anel de graxa na ranhura ao redor do orifício na lateral da câmara rotulada como superior. Evite usar a graxa em excesso, pois ela entrará na câmara e reduzirá a área observável. Usando fórceps.

Prenda uma lamínula limpa e não utilizada de 18 centímetros na parte superior da câmara. Aplique uma leve pressão na lamínula nas bordas para criar uma vedação firme dentro da ranhura rebaixada da câmara. Vire a câmara e aplique um anel semelhante de graxa na ranhura no lado oposto ou inferior da câmara.

Transfira 750 microlitros de meio de imagem para a câmara. Esta é uma quantidade excessiva, mas a graxa deve evitar que o meio transborde e o excesso evitará que as bolhas fiquem presas quando a lamínula coberta pela célula for aplicada. Mantenha a câmara preparada na incubadora de cultura de tecidos até que seja necessário.

Incubações prolongadas, como uma hora ou mais, devem ser evitadas, pois o meio de imagem evaporará e mudará de composição. Para a montagem final da câmara para imagens de estilo de vida, mova a câmara preparada e um prato de lamínulas transfectadas da incubadora para a capa de cultura de tecidos. Usando uma pinça estéril, remova cuidadosamente uma lamínula da placa transfectada.

Em seguida, toque a borda da lamínula em um lenço umedecido para retirar o meio de crescimento. Em seguida, coloque o lado do neurônio da lamínula voltado para baixo na câmara preparada. Toque em um lado da tampa, deslize primeiro para a graxa e aplique pressão nas bordas para deixar a lamínula plana sem prender bolhas.

Espera-se que o excesso de meio de imagem derrame, limpe o excesso de meio de imagem, mas tome cuidado para não deslizar a lamínula para fora da posição. Mova a câmara para o aquecedor de plataforma pré-aquecido e fixe a câmara no lugar. Em seguida, transfira a câmara para o estágio para reduzir o fotobranqueamento e a fototoxicidade.

Ajuste a lâmpada para a quantidade mínima de intensidade necessária para encontrar as células transfectadas. Agora encontre uma célula de interesse. Usando uma objetiva de óleo de baixa ampliação, como 40 x, é benéfico manter um padrão de pesquisa planejado para garantir a cobertura máxima da lamínula e evitar aquisições de imagens redundantes.

Uma vez que um campo desejado tenha sido localizado, mude o canal de uma proteína de interesse marcada com fluorescência. Mude para uma objetiva de óleo de alta ampliação, como 60 a cem x, e retorne a intensidade da lâmpada de volta a uma configuração alta, use a aquisição de fluxo ou uma função comparável do seu software de imagem para registrar a dinâmica de proteínas marcadas com fluorescência para organelas em movimento rápido. O tempo de exposição e o atraso entre as exposições devem ser minimizados para produzir gravações com uma alta taxa de quadros.

O desvio focal observado na visualização na tela pode ser corrigido em tempo real pelo ajuste manual do foco. Certifique-se de tirar uma imagem de fase e quaisquer outras imagens que a acompanhem necessárias para análise e apresentação posteriores. Salve todas as imagens antes de explorar mais a lamínula e fazer a próxima gravação.

Normalmente, três a cinco gravações de uma lamínula são consideradas bem-sucedidas e as lamínulas são visualizadas por 30 a 60 minutos, cada fototoxicidade na saúde celular geral deve ser mantida em mente à medida que os transportadores são reduzidos nas células danificadas. As observações de imagens de células vivas geralmente consistem em gravações, também conhecidas como pilhas de imagens que mostram o movimento de organelas marcadas com fluorescência dentro do campo de visão. Aqui está um filme representativo do transporte iCal de núcleo denso.

A cor foi invertida para facilitar a observação. Observe as partículas em movimento. Os gráficos CH são imagens que ilustram o movimento das partículas justapondo varreduras de linha, onde cada ponto de tempo é representado por uma coluna no gráfico.

Esta figura demonstra como duas partículas que se movem em direções opostas são representadas em um gráfico CH. Uma análise mais aprofundada dos cronógrafos pode fornecer informações sobre a velocidade do fluxo de partículas, reversões de comprimento de execução e partículas estacionárias. Olá, acabamos de mostrar como adquirir gravações de alta velocidade do transporte de vesículas dsco e neurônios capitais de hipopótamos cultivados.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de pré-aquecer todos os componentes da câmara de imagem e da plataforma para reduzir o estresse nas células durante sua transição da incubadora para o estágio. Você deve trabalhar rapidamente, mas com cuidado. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.