Prétraitement tissulaire FFPE pour l’ARN CISH : une procédure pour traiter des coupes de tissus fixées au formol et incluses dans la paraffine pour l’hybridation in situ chromogène de l’ARN

Le prétraitement des coupes de tissu fixées au formol ou incluses dans du FFPE facilite l’exposition des acides nucléiques et permet la liaison des sondes marquées à la séquence cible lors de l’hybridation in situ ultérieure. De plus, le prétraitement aide à maintenir l’intégrité des acides nucléiques dans les cellules et la morphologie globale des tissus.

Pour commencer, prenez une lame de verre portant une section de tissu FFPE déparaffinisé et réhydraté d’intérêt. Traitez le tissu avec une concentration appropriée de peroxyde d’hydrogène et incuber.

Le peroxyde d’hydrogène inactive de manière irréversible la peroxydase endogène, qui est physiologiquement présente dans les cellules. Ce processus de blocage élimine la possibilité de signaux de fond non spécifiques lors des étapes d’hybridation ultérieures.

Ensuite, plongez la section de tissu dans un bain chauffé contenant un tampon de récupération d’antigène approprié. Incuber pour la durée souhaitée. À haute température, les réticulations chimiques induites par le fixateur dans les protéines et les acides nucléiques, exposant les épitopes non masqués à des sondes lors du marquage ultérieur.

Enfin, traitez l’échantillon avec une solution de protéase appropriée. Incuber dans un environnement à humidité contrôlée. Les protéases augmentent l’accessibilité de l’ARN, ce qui permet aux sondes spécifiques d’atteindre leur séquence cible dans les étapes d’hybridation suivantes.

Lavez la section à l’eau pour éliminer les protéases résiduelles. Utilisez la coupe de tissu prétraité pour l’hybridation in situ chromogène de l’ARN.

Pour bloquer l’activité de la peroxydase sur des lames dont les sections de tissu ont été préalablement déparaffinées et placées dans un support à lames, ajoutez 4 à 6 gouttes de peroxyde d’hydrogène à chaque lame et incubez-les pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez les lames deux fois pendant 2 minutes dans de l’eau distillée à température ambiante. Pour briser les limites du tissu de l’ARN et les sections de tissu, retirez d’abord la feuille d’aluminium du TRR1x bouillant à l’aide d’une griffe et arrêtez de remuer.

Immergez le support à glissières lentement et très soigneusement. Couvrez à nouveau le bécher avec le papier d’aluminium et incubez pendant 15 minutes. Utilisez la griffe pour transférer immédiatement la grille de diapositives chaudes dans un bain-marie distillé et lavez-la pendant 2 minutes. Lavez ensuite les lames dans de l’éthanol frais à 100 % pendant 2 minutes et laissez-les sécher à température ambiante pendant 2 minutes.

Ensuite, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner une barrière autour de chaque échantillon et laissez-le sécher pendant au moins 5 minutes. Pour la digestion de la protéase, placez les lames dans le bac de contrôle de l’humidité et ajoutez environ 4 gouttes de Protease Plus par échantillon. Couvrez la plaque avec un couvercle et insérez-la dans le four d’hybridation pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius.

Sortez la plaque du four et retirez la grille coulissante. En travaillant une lame à la fois, retirez rapidement tout excès de liquide et placez la lame dans le support de diapositives immergé dans un plat de coloration rempli d’eau distillée. Lavez les lames deux fois pendant 2 minutes dans de l’eau distillée à température ambiante avec une agitation constante.