心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

脱細胞化組織、心膜組織、心筋組織から作製したマトリックスゲルは、多様なタンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカンなどの天然の細胞外マトリックス成分を保持しています。これらの組織マトリックスは、組織工学に使用できます。このビデオでは、心膜組織を脱細胞化することによりマトリックスゲルを作製し、無細胞細胞外マトリックスを生成します。

次に、細胞外マトリックスを処理して、可溶化した液体バージョンを作成します。次に、可溶化したマトリックスを小動物モデルで試験し、注射可能な足場としての実現可能性を判断します。組織学的および免疫組織化学的分析は、in vivoで、注入された材料が多孔質の繊維状足場を形成し、血管細胞の浸潤を可能にすることを示しています。

こんにちは、ソニア・ゼキと申します。私はカリフォルニア大学サンディエゴ校のカレン・クリスマン博士の研究室の大学院生です。本日は、脱細胞化組織から可溶化ECMを作製し、心臓組織工学アプリケーションのためのin vivo試験を実演します。

これらの技術は、心不全の治療のための注射可能な生体材料療法の開発にとって重要です。心筋梗塞後の外科的処置を示すパム、当研究室の獣医脳神経外科医であるマクガフィンを撃ちます。それでは始めましょう。

このプロトコルは、組織を脱細胞化して細胞外マトリックスまたはECMのみを残すことから開始し、ブタ心膜を脱イオン水のビーカーに入れ、室温で30分間攪拌して洗浄します。洗浄後、組織を1%SDSと1%ペニシリンストレプトマイシンを含むPBSの1倍に入れ、室温で24時間連続的に攪拌します。翌日、組織を脱イオン水に戻し、5時間連続的に攪拌し、すべての泡がなくなるまで50ミリリットルのチューブを振とうします。

ヘマチンおよびエオイン染色により、脱細胞化組織に核が存在しないことが明らかになるはずです。脱細胞化した組織の残りの部分を15〜50ミリリットルの円錐管に入れます。次に、ティッシュをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。

凍結したサンプルを、非常に低い圧力と非常に低い温度で完全に乾燥するまで凍結乾燥させます。使用するシステムとサンプルの水分含有量にもよりますが、これには12時間から72時間かかる場合があります。脱細胞化組織が完全に乾いたら、Wiley Minimミルに移します。

40ゲージのメッシュでセットアップし、ティッシュを微粉末に粉砕します。サンプルの大部分がフィルターを通過したら、収集ジャーを取り外します。このサンプルは現在、細胞外マトリックスまたはECMパウダーと呼ばれています。

第2の凍結乾燥ステップは、次のステップにすぐに続行しない場合、この時点で実施してもよい。これにより、ECMを可溶化するために記録された重量の精度が保証されます。必要な量のECM粉末を滅菌バイアルに計量します。

ミリグラム/ミリリットルを含む滅菌ろ過済み塩化水素溶液を追加します。ECM粉末を含むシンチレーションバイアルにペプシドを添加し、ECMがミリリットルあたり10ミリグラムの濃度になるようにします。攪拌子を追加し、バイアルを攪拌板の上に置きます。

48〜60時間連続して攪拌し、滅菌済みのWHEスプーンまたはヘラでバイアルの側面を定期的にこすり落とします。すべてのECM粉末の消化を確実にするため。ECMが消化されると、溶液に入ります。

ECMが可溶化されたら、サンプルを氷上に置いて、水酸化ナトリウムと塩酸を使用してpHを7.4に調整します。pHを調整したら、溶液の最終的な選別濃度がPBSの1倍になるように、PBSの10倍を加えます。例えば、900マイクロリットルのECM溶液がある場合、pH調整後、PBSの10倍の100マイクロリットルを追加する必要があります。

可溶化ECM溶液の濃度は、中和するために添加した容量とpHをテストするために除去した容量を集計して決定します。次に、PBSを1倍追加して、ここで目的の最終濃度に到達します。ミリリットルあたり6ミリグラム。

手術当日は、先端に30ゲージの針が付いた0.1ミリリットルの注射器に可溶化ECMを75マイクロリットル注射します。挿管された雌のハーランドリーラットの麻酔を2.5%のフッ素で維持します。.目を追加し、つま先をつまんで麻酔を確認します。

水分補給のために下腹部に皮下注射により3ミリリットルの乳酸リンガー溶液を投与します。.次に、動物を手術台の上で仰臥位に置き、手足をそっとテープで留めます。バリカンを使用して腹部の毛を取り除き、空いている髪を掃除機で吸い取ります。

剣状突起から腹部の右下への対角線に沿って、2%リドカインの50マイクロリットルの一連の注射を行います。次に、ベタジンを真ん中から始めて外側に向かって3回こすります。isop profile アルコールでスクラビングを繰り返します。

次に、事前に作られた円形の窓が付いた外科用ドレープを使用して動物を覆います。外科用ドレープで固定します。10番のメスを使用。

剣状突起から腹部の右下まで3〜4センチメートルの切開を行います。剣状突起の位置を特定し、右側の大きな血管を避けるように注意しながら、右側の筋肉を垂直に解剖します。次に、ハサミを使って横方向に切り込み、横隔膜を露出させている筋肉を切断します。

36インチの長さの3つのゼロVicryl縫合糸と一対の止血剤を使用して肝臓を避けるように注意してください。剣状突起に1本の針を打ち込み、縫合糸を途中で引き抜きます。縫合糸の端を一緒にテープで固定し、動物の上と後ろの点に固定し、剣状突起を持ち上げ、さらに36インチの長さの3つのゼロVicryl縫合糸で横隔膜を露出させます。

剣状突起に最も近い筋肉に針を打ち込み、再度、端を引っ張って手術台の右側にある別のポイントに固定し、手術腔を完全に露出させます。次に、小さなラット歯マイクロ鉗子を使って、横隔膜の中心をつかんで引き出し、鈍いハサミで非常に小さな切開を行います。この穴が開けられると、肺は引っ込みます。

横隔膜を通して垂直に2〜3センチの切開を行い、心臓を視覚化します。次に、キャビティの左側に3インチの綿棒を挿入し、肺を道から押し出します。タオルclを使用して綿棒を所定の位置に固定しますamp.

別の綿棒を使用して、心膜袋を見つけるために右肺を道の外に移動します。次に、一対のマイクロ鉗子と一対の大きな鋸歯状の鉗子を使用して、心膜袋を引き裂き、心臓の頂点を露出させます。右の歯のマイクロ鉗子で心臓の頂点をつかみ、針を挿入して可溶化マトリックスの斜めのエッジを左に注入します。

心外膜表面に平行な頂点から3分の1のところ。大静脈は避けてください。可溶化したマトリックスゲルを注入し、数秒待ってから針を抜く。

組織は注射部位で白くなり、腔内の血液を綿棒で拭き取り、湾曲したマイクロ止血剤を使用して右肺を保持しているタオルクランプと綿棒を取り外し、30インチの長さの5つのゼロプロリン縫合糸で最初の結び目を作る必要があります。次に、ラット歯のマイクロ鉗子を使用して、連続縫合糸とテーパー針で横隔膜を閉じてから完全に閉じます。PE one 60吸引チューブを挿入し、10ミリリットルの注射器を使用して胸腔を排出するために

縫合糸が引き締まると、横隔膜は凹面になります。フッ素の氷を1%に下げます空洞を開いたままにしている3つのゼロVicryl縫合糸の両方を取り出します。筋肉を水分補給し、綿棒または滅菌ガーゼで余分なものを拭き取ります。

新しい長さの3つのゼロ縫合糸を使用して、断続的な縫合糸で筋肉層を閉じます。次に、イソフッ素をオフにします。その部分をきれいにし、ホッチキスで皮膚を閉じます。

次に、切開部位にトリプル抗生物質軟膏を塗布します。ラットが100%酸素未満で回復するのを待ちます。動物が人工呼吸器の周りで呼吸を始めたら、気管チューブを取り外します。

動物が立ち上がったら、塩酸ブプレノルフィン鎮痛剤1キログラムあたり0.05ミリグラムの皮下注射を行い、滅菌タオルで自宅のケージに戻します。可溶性マトリックスゲルを注入したラットの心臓組織を切片化し、ヘマット、トイン、およびエオインで染色して、さまざまな時点で肉眼的組織分析を行いました。初期の時点での手術後、注入された領域は、後の時点で間質性に広がったピンク色の線維性ネットワークとして現れます。

細胞流入は2週間後に観察されます。注入されたマトリックスの劣化が見られます。ECMを注入前にビオチンで標識していた場合は、ビオチンをHRP標識ストレプトアビジンで染色することで、マトリックス注入領域での血管の内部成長と形成を可視化することで、より直接的に可視化することができます。

ここのスライドは、fitzyで共染色されています。コンジュゲートは、緑色で示されている内皮細胞に結合するセレクチンと、抗平滑筋です。赤色幹細胞に示されるアクチン抗体も、注射領域の近くで同定され得る。

ここでは、Cキットの免疫組織化学染色試薬で可視化されています。このビデオを見れば、脱細胞化組織から可溶化ECMを作成し、心臓組織工学アプリケーションのためにin vivoで試験する方法を十分に理解できるはずです。心膜組織を使用する一方で、この一般的な手順は変更され、任意の組織ソースで使用されることを忘れないでください。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。