Préparation des tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique

La vidéo que vous êtes sur le point de voir contient les procédures expérimentales utilisées pour isoler et préparer le tendon de la queue de rat pour les études biologiques biomécaniques et mécaniques. Le but de cet article est de démontrer les méthodes et les instruments qui ont été développés et optimisés afin de maintenir la viabilité, la stérilité et l’intégrité des tissus dans la procédure de préparation. Nous aborderons plusieurs caractéristiques concernant les principales étapes de la préparation, en commençant par l’extraction, suivie de la mesure de la section transversale, du rinçage et enfin du chargement dans la chambre du bioréacteur.

Commençons. L’extraction est la première étape de la préparation afin de conserver la viabilité cellulaire. Toutes ses manipulations sont effectuées en solution seline froide.

Après le rattiisation, la queue est réséquée, rincée avec de l’éthanol à 70 % et transférée dans une boîte contenant une cellule et une solution et conservée sur de la glace. Pour faciliter l’extraction du tendon, la peau doit être retirée. Compte tenu du fait que nous travaillons avec des tendons ventraux.

Comme ils sont plus petits et aussi faciles à manipuler avec notre équipement, une incision est pratiquée tout le long de la face dorsale de la queue. L’orientation correcte de la queue est ensuite vérifiée en observant l’anatomie à l’extrémité proximale. Comme nous pouvons le voir, la face ventrale présente un plus grand nombre de tendons et la présence d’un vaisseau sanguin peut être vérifiée par les gouttes de sang obtenues.

En serrant doucement la queue, l’incision est réalisée. En commençant par l’extrémité proximale et en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux. On prend soin de manipuler la queue par ses extrémités.

Lorsque l’incision est terminée, la peau est retirée, en commençant également par l’extrémité proximale à l’aide des doigts ou d’une pince. Encore une fois, on prend soin de manipuler la queue par ses extrémités. Ensuite, la queue est rincée dans La solution pour enlever les poils et le sang.

L’échantillon est ensuite transféré dans un plat contenant une solution fraîche et conservé sur de la glace. À ce stade, l’expérimentateur change de gants pour exposer le tendon. L’extrémité distale de la queue est réséquée de deux à trois vertèbres plus courtes.

Les vertèbres sont les faisceaux visibles entre les faisceaux de tendons et elles peuvent également être ressenties en faisant glisser les doigts tout le long de la queue. Vue en microscopie optique d’une coupe transversale réalisée le long de la vertèbre. L’extrémité skoale montre qu’il y a six groupes de tendons différents puisque le tendon de chacun d’eux est attaché à la vertèbre et que nous n’utilisons que les tissus ventraux.

Quatre tendons sont retirés à chaque coupe, deux des groupes inférieurs et deux des groupes latéraux. Pour réaliser la résection, vous pouvez utiliser un cisaillement chirurgical pour briser le disque intervertébral et un scalpel sur une planche à découper pour les tissus mous. À ce stade, la face ventrale est reconnue par la présence d’un spon tendineux plus gros.

Une fois l’orientation vérifiée, le tendon est doucement extrait de l’extrémité distale à l’aide d’une pince Lorsqu’il n’est plus possible d’extraire des tissus, la queue est réséquée sur l’épaule vertébrale comme indiqué précédemment. Après l’extraction, le tissu est immédiatement immergé dans la solution et en tenant les deux extrémités, le tendon est transféré dans une plaque de manipulation contenant également la solution cellulaire et sur laquelle du ruban adhésif est utilisé pour identifier l’extrémité proximale. Une analyse microscopique de la section longitudinale teintée h et e montre qu’en utilisant cette méthode simple et répétitive, le joint de tissu extrait a un réseau de collision bien aligné et densément tassé.

Après manipulation, lorsque les tissus subissent une stimulation mécanique, nous décrivons leurs propriétés mécaniques en normalisant la force à l’intérieur pour stresser. Par conséquent, nous devons évaluer leur section transversale. Pour ce faire, le profil du locataire est reconstruit à l’aide d’une stéréomicroscopie équipée d’une caméra numérique.

Avec cette méthode, l’intégrité des tissus est préservée puisque la charge de neige ou le stress y sont directement appliqués. L’appareil photo numérique prend des photos de la projection du locataire sur 180 vues. Dans un cadre de référence, un algorithme d’assistant de vision localise les bords supérieur et inférieur de l’échantillon.

Ensuite, un algorithme avec le logiciel MATLAB est utilisé pour effectuer la reconstruction du profil. Un micromètre optique a été conçu pour maintenir le tissu dans la zone focale. Étant donné qu’en dehors de cette région, la projection est floue et la mise au point décalerait le cadre de référence local.

Le micromètre comprend un compartiment de mesure pour prévenir la déshydratation des tissus. Deux systèmes de positionnement avec platine rotative, permettant la rotation de l’échantillon et deux dispositifs d’ancrage fabriqués avec des tubes en silicone comprimés contre les couleurs de l’arbre. Tout d’abord, le compartiment de mesure est rempli d’une solution de cellule froide jusqu’à ce qu’une entrée de tubes en silicone soit immergée.

Ensuite, l’astronaute est transféré dans le compartiment de mesure à l’aide d’une pince et en ne tenant que ses extrémités. En utilisant un EPI de micro volume, les extrémités du tendon sont aspirées par section dans les tubes en silicone. L’aspiration est ensuite effectuée jusqu’à ce que l’extrémité s’étende au-delà des couleurs de la tige.

Une fois que les deux côtés sont terminés, les couleurs de l’arbre sont serrées à l’aide d’une clé de cou pour comprimer le tube. Maintenant que le tendon est fixé, l’appareil est installé sous la coupelle du micro stéréo. Le tendon peut être observé directement sur l’écran de l’ordinateur à un grossissement de 105.

Pour plus de cohérence, le tendon est étiré jusqu’à ce que les plis ne soient plus perceptibles, suivi d’une déformation supplémentaire de 0,4 %. Étant donné que l’échantillon est représenté de zéro à 170 degrés, la position initiale et la mise au point sur le réglage sont nécessaires pour obtenir une image claire sur toute la circonférence. En fait, 18 photos sont prises où la rotation de l’échantillon est augmentée de 10 degrés entre chaque vue.

Avec cette méthode, il est possible d’estimer la section transversale d’un tendon de queue de rat sans endommager les tissus. À la fin, une reconstruction du profil est obtenue avec une marge d’erreur de 0,5 à 2 %. Après la mesure, les tissus sont rincés pour éviter la contamination qui aurait pu se produire lors des manipulations précédentes.

Des plaques de manipulation stériles contenant une solution de prise fraîche sont placées dans l’armoire, l’une étant utilisée pour la procédure de rinçage tandis que l’autre recevra le tendon de rinçage. L’expérimentateur lave son gant avec de l’éthanol à 70 % avant d’introduire le tendon extrait dans l’armoire de biosécurité. En ne tenant que les extrémités, le tendon est soigneusement transféré de puits en puits.

Enfin, il est transféré dans une plaque de manipulation individuelle contenant également une solution cellulaire stérile. Pour la validation du protocole, nous avons effectué des tests de viabilité et de stérilité. La viabilité des cellules a d’abord été évaluée à l’aide d’un kit de cytotoxicité de viabilité des cellules de mammifères.

Après une culture de 12 jours, une grande majorité de cellules vivantes fluorescentes vertes ont été visualisées, confirmant que les procédures d’isolement réussissent à préserver les tissus vivants. Des examens ont ensuite été effectués pour vérifier la contamination de la culture utilisée. Le milieu a été plaqué sur gélose et incubé pendant 10 jours car aucune croissance bactérienne n’a été observée.

Nous avons constaté que nos manipulations sont stériles. L’utilisation du système d’ancrage exploite l’avantage de la déshydratation des tissus et la colle pour les petits spécimens tels que la queue de rat, les tendons, la colle pénètre dans les tissus. C’est un problème dans toutes les sous-unités, tandis que la déshydratation améliore ses propriétés mécaniques pour éviter une contamination supplémentaire.

Toute la procédure de chargement est effectuée sous une enceinte de biosécurité où tous les composants de l’instrument et de la chambre sont stériles. Pour l’opération de chargement, la chambre du bioréacteur est fixée sur un gabarit de positionnement. Deux bras mobiles sont réglés pour recevoir les ancrages des tendons.

Un couvercle ferme la chambre pour éviter toute contamination. Tout d’abord, les ancres sont déposées aux extrémités de la plaque de manipulation. Leurs bobines sont centrées avec l’axe longitudinal de la rainure et sur le tendon.

Le tendon est ensuite enroulé autour d’une ancre. L’ancre est retournée pendant environ trois quarts de tour pendant que le corps du tissu reste dans la solution. En tenant l’extrémité lâche, nous assurons l’attachement du tissu à l’ancrage.

La même procédure est ensuite répétée pour l’autre extrémité. Une fois que les deux côtés sont fixés, les ancres sont roulées ou déroulées uniformément jusqu’à ce qu’il y ait six centimètres. Entre les deux extrémités, deux gouttes de 2,5 microlitres d’ocreate se déposent sur les tendons partie blessée.

Pour entrer dans l’adhérence, des précautions sont prises. Pour éviter de mettre de la colle dans la solution cellulaire, un minimum de cinq minutes est nécessaire pour que la colle sèche complètement. Pour valider notre protocole, nous avons effectué des tests pour vérifier l’influence de la déshydratation de la colle et du point d’ancrage sur la viabilité des tissus.

Après deux heures, nous avons observé que l’affection des extrémités ne s’était pas propagée sans le tissu. En fait, il y a une limite de couleur bien définie marquant la limite des cellules mortes fluorescentes rouges trouvées au point d’ancrage et la majorité des cellules de vie vertes du corps tissulaire. Entre-temps, la chambre du bioréacteur est remplie de milieux de culture frais.

Une fois que la plaie d’une partie du tendon est sèche, elle est réhydratée avec une solution cellulaire. Ensuite, le tissu ancré est transféré dans la chambre à l’aide d’une pince. Le couvercle est fermé pour éviter toute contamination supplémentaire.

Le gabarit de positionnement sera retiré une fois la chambre installée dans le bioréacteur. Nous venons de démontrer comment préparer un tendon de queue de rat pour des études biomécaniques et biologiques mécaniques. En appliquant ces procédures, nous pouvons mener une grande variété d’études in vitro sur ces tissus.

Par exemple, une étude sur la dégénérescence tissulaire a été réalisée par l’application d’une sous-stimulation pendant une période de 10 jours. Chaque jour, nous avons évalué les tissus, les propriétés mécaniques et l’essai de relaxation non destructive des contraintes. À la fin, nous avons pu observer la variation du stress.

Nous avons fourni la preuve que nos procédures rigoureuses d’isolement et de préparation permettent de maintenir la viabilité, la ité et l’anti-fertilité des tissus. Merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos propres expériences.