Préparation à base d’agarose de tranches de poumon humain coupées avec précision

Commençons par un poumon humain réséqué.

Insérez un tube de silicone dans la bronche principale du poumon. Fixez le tube, en fournissant une voie pour l’introduction de l’agarose dans le tissu dans les étapes suivantes.

Serrez les autres bronches et vaisseaux pour éviter les fuites d’agarose pendant le remplissage.

Introduisez dans les poumons de l’agarose préchauffée à faible teneur en gélification mélangée à du milieu jusqu’à ce qu’elle soit complètement gonflée.

Placez le poumon sur de la glace pour la polymérisation de l’agarose, formant une matrice de gel solide qui assure la stabilité du tissu et maintient l’architecture pulmonaire pendant les procédures de section.

Après polymérisation, coupez le tissu pulmonaire en plaques uniformes. Extraire des carottes de tissus cylindriques des plaques de tissus.

À l’aide d’une trancheuse à tissus remplie d’un tampon réfrigéré, coupez le noyau de tissu pour obtenir des tranches de poumon coupées avec précision.

Transférez les tranches dans une plaque de culture contenant des milieux réfrigérés. Incuber pour stabiliser les tissus.

Enfin, transférez les tranches dans une plaque multipuits contenant un support. Les tranches de poumon préparées et coupées avec précision sont maintenant prêtes pour les expériences.

Pour commencer cette procédure, canulez la trachée en insérant le tube en silicone et fixez-le avec une pince parallèle au tube afin que la pince comprime le tissu le long du tube en silicone sans le pincer. Fermez toutes les autres bronches, vaisseaux sanguins et blessures avec des pinces afin qu’aucune agarose ne puisse s’échapper pendant la procédure de remplissage.

De bonnes compétences anatomiques sont nécessaires pour canuler la bronche principale. Les poumons ne doivent pas être trop dilatés, sinon le tissu distraira, et si le tissu n’est pas assez rempli, il sera impossible de faire un PCLS car le tissu est trop mou.

Ensuite, mélangez un volume équivalent d’agarose à faible teneur en gélification à 3 % avec un milieu de culture dans un bécher et instillez le mélange dans le poumon à l’aide d’une seringue de 50 millilitres. Avant de remplir à nouveau la seringue avec du fluide, fermez le cathéter avec les doigts ou une pince pour éviter les bulles d’air et le flux sans agarose. Coupez le tissu pulmonaire en plaques de 3 à 5 centimètres.

Remplissez la trancheuse à mouchoirs avec 400 millilitres d’EBSS glacé. Découpez immédiatement les noyaux de tissu cylindriques dans les dalles pulmonaires à l’aide d’un tournevis semi-automatique avec un outil de carottage. Ensuite, transférez les carottes de tissu dans le support de tissu de la trancheuse de tissus. Placez le poids sur le noyau tissulaire et commencez à trancher le noyau tissulaire en PCLS. Le fluide doit être évacué de la trancheuse à tissus dans un bécher en ouvrant la pince du cylindre de verre.

Ensuite, transférez les tranches d’un bécher dans la boîte de Pétri avec un milieu de culture. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans un incubateur et laissez le milieu se réchauffer avant les étapes de lavage. Ensuite, transférez soigneusement les tranches de poumon dans une plaque de culture de 24 puits avec un minimum de 500 microlitres de milieu de culture pour deux tranches par puits.