Un test pour quantifier la liaison des VLP du norovirus humain aux bactéries intestinales

Prenez un tube contenant une suspension de bactéries intestinales humaines.

Ajoutez des particules de type virus de norovirus humain, ou VLP. Les VLP contiennent une capside virale intacte mais n’ont pas d’ARN génomique, ce qui les rend non infectieuses pour les humains.

Pendant l’incubation, les protéines de la capside VLP se lient à des glucides spécifiques exprimés à la surface bactérienne, formant des complexes VLP-bactéries.

Centrifuger pour granuler les complexes et jeter les VLP non liés.

Introduisez une solution bloquante contenant des protéines pour bloquer les sites de liaison d’anticorps non spécifiques, réduisant ainsi la coloration de fond dans les étapes suivantes.

Ajoutez des anticorps spécifiques à la VLP marqués par fluorescence et incuber.

Les anticorps se lient à leurs sites cibles sur la capside VLP, marquant les complexes VLP-bactéries.

Centrifugeuse pour granuler les complexes. Jetez les anticorps non liés et remettez la pastille en suspension dans un tampon de cytométrie en flux.

À l’aide d’un cytomètre en flux, détectez les signaux de fluorescence émis par les complexes VLP-bactéries, ce qui permet de quantifier le pourcentage de bactéries liées dans l’échantillon.

Après avoir préparé les réactifs, les anticorps et les bactéries comme décrit dans le manuscrit, assemblez tous les matériaux dans une enceinte de biosécurité BSL II.

Les particules pseudo-virales pour les norovirus humains sont répertoriées comme des agents pathogènes BSL II, et tous les travaux effectués à l’aide de VLP doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité certifiée.

Ajoutez 10 microgrammes de VLP de norovirus humain dans chaque tube de bactéries et mélangez soigneusement par pipetage. Incuber les tubes pendant 1 heure à 37 degrés Celsius avec une rotation constante. Après l’incubation, centrifugez les tubes à 10 000 fois g pendant 5 minutes.

Aspirez et jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille bactérienne dans 1 millilitre de PBS. Après avoir répété les étapes de lavage une fois, centrifugez à nouveau les tubes à 10 000 fois g pendant 5 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de bactéries VLP dans 150 microlitres de tampon de blocage à 5 %.

Une erreur courante qui se produit est que les tubes sont échangés et que le mauvais traitement est ajouté. Pour éviter cela, disposez tous les tubes en lignes qui correspondent au traitement correct, et ajoutez un traitement en une seule fois aux tubes.

Pour chaque échantillon bactérien, préparez 50 microlitres d’anticorps anti-norovirus humain G2 dilué. À l’aide d’un tampon bloquant à 5 %, diluez les anticorps 1 à 125 pour les échantillons de cas d’E. coli. Préparez 50 microlitres d’anticorps isotype dilué pour chaque échantillon bactérien en utilisant les mêmes taux de dilution. Divisez chaque échantillon de test d’accessoire en aliquotes de 350 microlitres en les transférant dans des tubes à centrifuger propres de 1,5 millilitre.

Pour créer des témoins non colorés, ajoutez 50 microlitres de tampon de blocage à la première aliquote de chaque échantillon bactérien. Pour les échantillons colorés, ajoutez 50 microlitres de dilution de l’anticorps G2 à la deuxième série d’aliquotes. Créez les contrôles d’isotype en ajoutant 50 microlitres de l’anticorps isotype dilué à la troisième série d’aliquotes.

Incuber tous les échantillons sur de la glace et dans l’obscurité pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez tous les échantillons à 10 000 fois g pendant 5 minutes. Jetez les surnageants et remettez en suspension chaque échantillon dans 150 microlitres de FCSB. Encore une fois, centrifugez tous les échantillons à 10 000 fois g pendant 5 minutes. Encore une fois, jetez les surnageants et remettez les échantillons en suspension dans 100 microlitres de FCSB.

Après avoir centrifuge les échantillons une dernière fois et jeté le surnageant, remettre les échantillons en suspension dans 150 microlitres de FCSB. Transférez chaque échantillon dans un tube contenant 400 microlitres de FCSB pour un volume total de 550 microlitres. Conservez les échantillons à 4 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient analysés par cytométrie en flux.