Imagerie en temps réel des leucotriènes B _{4 Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine}

Le leucotriène B quatre est une molécule pro-inflammatoire qui exerce ses effets par l'intermédiaire des récepteurs couplés aux protéines G, BT un et BT deux, présents sur divers types de cellules inflammatoires. La voie de signalisation LTB quatre/BT un s'est révélée essentielle dans plusieurs maladies inflammatoires, notamment l'asthme, l'arthrite et l'athérosclérose. Les récepteurs couplés aux protéines G, ou RCPG, assurent la transduction de signaux extracellulaires conduisant à des réponses intracellulaires telles que la chimiotaxie, la libération de calcium intracellulaire et la régulation génique.

La liaison du ligand extracellulaire induit une série de changements conformationnels conduisant à l'activation des protéines G hétérotrimériques. Les protéines G modulent ensuite les niveaux de messagers secondaires, tels que l'adénosine monophosphate cyclique, un acétyl triphosphate et le glycérol DYL, afin de surveiller en temps réel la migration cellulaire induite par le leucotriène B4. Des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse, ou B MDCs, sont observées pendant qu'un chimiocaptateur est délivré par flux contrôlé à partir d'une micropipette. Une imagerie en laps de temps est réalisée pour évaluer la migration.

En utilisant ces techniques d'imagerie en temps réel sur cellules vivantes, notre laboratoire a découvert que le récepteur BT1 du leukotriène B4 est fonctionnellement exprimé sur les cellules dendritiques. Nous avons également identifié les mécanismes de phosphorylation et de recrutement de la bêta-arrestine impliqués dans l'internalisation de BT1. Le Dr Jla, professeur adjoint dans notre laboratoire, qui a mis au point plusieurs de ces techniques, démontrera à la fois la migration des cellules vivantes et l'internalisation des récepteurs. Pour préparer les cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse (B MDC) en vue de tests de migration cellulaire, placer 0,5 million de cellules dans un milieu de culture RPMI 1640 contenant du G-M-C-S-F recombinant, du FPS et du FLT3 recombinant, dans une boîte de 35 millimètres à fond en verre.

Une fois ensemencées, incuber les cellules pendant 16 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ajouter trois millilitres de PBS, puis aspirer. Répéter ce lavage au moins deux fois supplémentaires ; après la dernière aspiration, ajouter deux millilitres de PBS dans la plaque.

Les cellules sont désormais prêtes pour l'expérience et doivent être maintenues à 37 degrés Celsius. Jusqu'alors, le système d'imagerie utilisé pour les expériences présentées dans cette vidéo est constitué d'un système épifluorescent A-T-E-F-M relié à un microscope inversé Nikon Eclipse TE 300, équipé d'une platine chauffante et d'une caméra numérique CCD monochrome Cool SNAP hq.

Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission sont contrôlées à l'aide de roues à filtres et d'un contrôleur de roue à filtres Lambda 10 dash two. Le logiciel MetaMorph gère le contrôle du matériel et l'acquisition des images. Deux micromanipulateurs sont fixés sur la platine du microscope pour maintenir les pipettes, qui peuvent être fabriquées selon les instructions fournies dans le texte accompagnant ou achetées prêtes à l'emploi.

Transférez 1,5 millilitre d'une solution mère de 100 nanomolaire du ligand pro-inflammatoire leucotriène B quatre ou LTB quatre dans un tube fuge de 1,5 millilitre. Remplissez la micropipette par aspiration en plaçant l'embout de la micropipette dans la solution et en laissant la solution pénétrer ; cette méthode de chargement empêchera la formation de bulles d'air à l'extrémité de la micropipette. Ensuite, chargez une seringue tuberculinique d'un centimètre cube, reliée à une aiguille microfill, avec un millilitre de LTB quatre.

Ensuite, utilisez-le pour remplir lentement une micropipette par le haut ; reliez un tube à la micropipette remplie de LTB. Puis, connectez la micropipette et le tube à une aiguille de 21 gauge, d'une longueur d'un pouce et demi, fixée à une seringue d'un millilitre, également remplie de ligand. Fixez maintenant soigneusement la micropipette remplie de ligand à l'un des micromanipulateurs situés sur la platine du microscope afin d'effectuer une imagerie en temps réel de cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse.

En réponse à l'application du ligand LTB4, retirer les bMDC immatures ensemencés de l'incubateur et les placer sur la platine chauffante du microscope. Mettre les cellules en évidence à l'aide d'un objectif à immersion huile de 60 x. Rechercher une zone où les cellules ne sont pas trop densément groupées, afin que la migration puisse être correctement surveillée.

Retirez le couvercle de la boîte fluoro. Ensuite, à l’aide du manipulateur manuel grossier, abaissez soigneusement la pipette chargée de ligand et approchez-la. Rapprochez-vous au maximum des cellules à l’aide du manipulateur microhydraulique fin.

Mettre la pipette au point. Appliquer une légère pression à l’aide de la seringue pour amorcer la libération lente du ligand LTB4 à partir de l’extrémité ; le ligand doit se diffuser lentement dans le milieu par diffusion. Ensuite, à l’aide du logiciel MetaMorph, régler les paramètres d’acquisition d’image pour acquérir une image en champ clair toutes les 15 secondes pendant deux heures.

Continuer la surveillance toutes les cinq minutes pour suivre la progression de la migration vers le ligand. La méthode décrite dans ce protocole a été utilisée pour déterminer la migration des cellules dendritiques vers le leucotriène B4. Ici, la migration des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de souris vers 100.

L'animal Nan ou l'LTB4 est observé dans cette vidéo d'imagerie en temps réel, qui montre la migration de cellules vivantes de B MDCs vers l'LTB4. Des méthodes similaires peuvent être appliquées pour déterminer la réponse chimiotactique de nombreux types cellulaires à divers chémoattractants. Ce type d'imagerie, combiné à des molécules marquées par des protéines fluorescentes, peut être utilisé pour suivre en temps réel les mouvements et les interactions des molécules dans des cellules vivantes.

Ici, nous démontrons en temps réel les interactions entre le récepteur un de la leucotriène B quatre marqué par un fluorochrome et l'arrestine bêta. RBL deux H trois est une lignée cellulaire de leucémie basophile de rat isolée à partir de rats Wistar, disponible auprès de l'A TCC. Ces cellules n'expriment pas de nombreux récepteurs de chimiokines, mais possèdent les composants cellulaires nécessaires pour médier des voies de signalisation dépendantes des chimiokines.

Pour évaluer en temps réel l'internalisation induite par le ligand du BT un, des cellules RBL deux H trois sont transfectées avec le BT un RFP et la bêta-arrestine GFP. Pendant l'acquisition d'images en laps de temps, le ligand est ajouté à la plaque. Les changements de localisation de ces protéines peuvent être évalués par analyse d'image.

Pour étudier l'internalisation du récepteur G PCR R en temps réel, transfectez le gène B LT one RFP et la bêta-arrestine GFP dans des cellules RBL two H three selon les instructions fournies dans le texte accompagnant. Ensuite, transférez 300 microlitres du mélange de cellules électroporées et de milieu de croissance ordinaire dans des boîtes fluoro de 35 millimètres contenant deux millilitres de milieu de croissance ordinaire. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée composée de 95 % d'air et de 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre leur adhésion au fond de la boîte.

Après une heure, remplacer le milieu de transfection par du milieu de croissance ordinaire et remettre les cellules dans l’incubateur pendant 18 à 24 heures supplémentaires. À l’issue de l’incubation, laver les cellules deux ou trois fois en ajoutant deux millilitres de RPMI chaud sans rouge de phénol contenant 10 millimolaire de hippies directement dans la plaque, puis en aspirant les milieux. Ajouter ensuite 1,8 millilitre supplémentaire.

Ensuite, placez la boîte de culture sur le plateau chauffé du microscope. Acquérez des images à un grossissement de 600 x à l’aide d’un objectif à immersion huile de 60 x. Puis passez au filtre de fluorescence approprié.

Choisissez une cellule saine exprimant HBL BT un RFP à la surface cellulaire et capturez ici l'image. À l'aide du filtre RFP, passez au filtre GFP, vérifiez que l'arrêt bêta et GFP sont exprimés dans le cytoplasme, puis capturez l'image. Examinez ensuite les images pseudo-colorées fusionnées afin de vous assurer qu'il n'y a pas de recouvrement de fluorescence, qui peut survenir en raison d'une erreur.

L'adressage des récepteurs ne se produit pas entre le RFP et le GFP. Ensuite, saisissez ici les paramètres pour l'acquisition en laps de temps. Des images en 16 bits sont acquises avec le réglage de courbure de la caméra fixé à un par un.

Les images de fluorescence rouge et verte sont capturées séquentiellement à l’aide de filtres de fluorochromes RFP et GFP via un séparateur de faisceau R-F-P-G-F-P. Configurez le logiciel pour acquérir des images à des intervalles de temps de 32 secondes pendant une heure. Réglez les temps de pose de la caméra de manière à obtenir des gammes dynamiques similaires.

Pour l'intensité de fluorescence de la RFP et de la GFP, collectez des images pendant une minute, puis, à t égal à zéro, ajoutez directement les 200 microlitres du ligand dans la plaque sans la perturber.

Continuer à acquérir des images de fluorescence pendant 60 minutes. Après l'ajout du ligand, les images seront automatiquement enregistrées sous forme de fichiers TIFF avec des noms de fichiers séquentiels au fur et à mesure de leur acquisition. Les fichiers peuvent ensuite être visualisés individuellement ou combinés à l'aide du logiciel.

Enfin, une fois toutes les images cellulaires acquises, acquérez des images avec le milieu seul (sans cellules) en utilisant les mêmes paramètres. Enregistrez les fichiers pour les utiliser comme images de fond afin d'analyser les images. Utilisez la fonction de soustraction d'image dans MetaMorph pour soustraire le fond des images de données réelles obtenues ci-dessus.

Cela permettra de prendre en compte tout fond ou autofluorescence provenant du milieu. Ensuite, dans le menu Fichier, ouvrez l'option de fichier de pile généré final et chargez les piles d'images individuelles. Ensuite, dans Mesures de région, sélectionnez Tracé de région elliptique et dessinez les régions d'intérêt ; sélectionnez les régions membranaires et cytosoliques afin de mesurer l'intensité de fluorescence de RFP et de GFP correspondant respectivement à la translocation de BLT1 et de la bêta-arrestine.

À l'aide de l'option de données logarithmiques, qui crée automatiquement un lien avec Excel, reportez la quantité d'intensités de fluorescence en fonction du temps. Ce graphique fournira des informations sur la cinétique de translocation d'une molécule donnée. L'analyse d'image peut révéler la localisation des protéines G PCR R, des protéines cytosoliques et du noyau.

Ici, l'expression de BT one RFP à la surface d'une cellule RBL two H three est visible. Cette image montre la localisation de beta rest et de la GFP dans le cytosol de la même cellule, et ici p nuke CFP est visible dans le noyau. L'image combinée en couleurs présentée ici indique la localisation cellulaire distincte de chaque fluorochrome. L'interaction induite par le ligand entre les RCPG de surface et les protéines cytosoliques peut également être évaluée ici.

Translocation induit par un ligand du récepteur BLT1 et de la bêta-arrestine. Cette vidéo montre l'imagerie en temps réel d'une cellule exprimant BLT1-RFP et la bêta-arrestine-GFP. Après l'ajout de un micromolaire de LTB4, la quantification des profils de translocation peut être suivie à l'aide du logiciel MetaMorph.

Un balayage linéaire des intensités de fluorescence dans une cellule représentative est montré à T égal à zéro. BT1-RFP est observé au niveau de la membrane et la bêta-arrestine GFP est visible dans le cytosol. Après l'ajout du ligand, un recouvrement des lignes RFP et GFP est observé, suggérant une colocalisation du récepteur et de la bêta-arrestine.

En outre, la cinétique du mouvement des protéines peut être déterminée ici. La cinétique de l'internalisation des récepteurs et de la translocation de l'arrestine bêta. Elle a été examinée après l'ajout d'un micromolaire de LTB quatre.

Les intensités de fluorescence ont été mesurées en fonction du temps aux emplacements membranaires et cytosoliques de la cellule. L'ajout du ligand LTB4 aux cellules RRB2H3 transfectées avec BT1-RFP et bêta-arrestine1-GFP entraîne la translocation de bêta-arrestine1-GFP du cytosol vers la membrane, observable sous la forme d'un anneau jaune apparaissant en moins d'une minute. Lors de son interaction avec bêta-arrestine1-GFP, BT1-RFP forme un complexe récepteur-bêta-arrestine1-GFP qui transloque à travers le cytosol sous forme d'endosomes, comme en témoigne l'apparition de points jaunes en cinq minutes. À l'aide de ces méthodes, il est possible de déterminer l'état d'activation du récepteur dépendant du ligand ainsi que les motifs ou processus critiques impliqués dans l'activation du récepteur.

La chose la plus importante dans l'expérience est de surveiller attentivement le tampon dans la plaque pendant son fonctionnement. L'expérience se prolongeant au-delà d'une heure après son démarrage. Cette technique est apparue aux chercheurs dans le domaine des chimioquines et de leurs récepteurs pour explorer la migration cellulaire et les interactions ligand-récepteur dans divers types cellulaires de mammifères.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place des expériences d'imagerie en temps réel impliquant des chimioattractants et leurs récepteurs, ainsi que leurs interactions avec des protéines cytosoliques telles que les bêta-arrestines.