폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 버려진 전두엽 피질 조직에서 인간 신경 줄기세포를 분리하는 것입니다. 이것은 인간 태아의 뇌를 해부하기 전에 먼저 용액과 물질을 미리 준비함으로써 달성됩니다. 그 다음에는 추가 확장, 특성화 및 실험을 포함하여 분리된 신경 줄기 세포의 유지 관리가 이어집니다.

장기 보관은 전구세포를 신경세포(neuronal) 및 신경교세포(glial cell) 유형으로 분화시키기 위한 하위배양(subculture)의 확립과 마찬가지로 가능합니다. 궁극적으로, 정상 CNS에서 세포의 분화를 특성화하고 알려진 신경 장애가 있는 CNS에서 유래한 세포의 분화와 비교할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 모든 인간 CNS 장애의 치료 또는 진단으로 확장됩니다.

이 기술은 병리학적 S를 평가하고 주어진 장애에 대한 신약의 약리학적 효능을 평가할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 다분화능 세포의 탁월한 가치 때문에 모든 물질은 프로토콜을 시작하기 전에 준비되어야 합니다. 샘플의 손상 위험을 최소화하기 위해 냉장 해부, 섭씨 37도의 배양물을 예열한 중욕, 중형 및 냉장 세포, 냉동 배지를 장기간 준비했습니다.

해부를 위한 냉동 보존, 멸균 오토클레이브 겸자와 세포 해리를 위한 손잡이가 있는 메스 칼날이 있습니다. 피펫 건, 10ml 전사 피펫 및 40마이크로몰 셀 스트레이너가 있어야 합니다. 해부를 위해 10cm 배양 접시 여러 개를 준비하십시오.

해리를 위한 50 밀리리터 원심분리 튜브. 조직 저장을 위한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브와 세포 동결을 위한 냉동 바이알을 사용하여 성공을 보장합니다. 18주에서 22주 된 생존 가능한 조직은 사용 가능한 후 2시간 이내에 채취해야 합니다.

이상적으로는, 태아 조직은 선택적 시술 후 채취하기 위한 준비를 함으로써 사용 가능한 후 몇 분 이내에 가질 수 있습니다. 조직은 종종 파편화되어 있지만 뇌의 상당 부분은 손상되지 않은 상태로 남아 있습니다. 얼음처럼 차가운 해부로 채워진 10ml 페트리 접시에 뇌를 모으십시오. 보통.

해부학적 랜드마크로 피질의 다른 부분을 식별합니다. 전두엽(frontal cortices)과 두정엽(parietal occipital cortices)의 경계는 중앙 열구(central sulcus)와 실(syl fessure)의 외삽된 교차점에 의해 배향됩니다. 전두엽 피질에서 중앙 열구까지 그리고 수술용 칼날로 실반 열구의 경계를 따라 조직을 절개합니다.

심실이 손상되지 않고 손상되지 않도록 하십시오. 이제 분리된 전두엽 피질 블록에서 잔여 혈액과 수막을 제거합니다. 샘플이 너무 단편화되지 않고 충분히 큰 경우 블록을 여러 개의 더 작은 샘플로 해부하여 조직학 및 단백질 또는 mRNA 분석을 위해 일부를 저장합니다.

이제 뇌 블록을 50ml 원심분리기 튜브로 옮기고 조직 부피의 3배인 얼음 저온 해부 배지를 추가합니다. 피펫을 사용하여 모든 조직이 조각화될 때까지 조직을 부드럽게 해리합니다. 세포를 완전히 현탁시키려면 40마이크로몰 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다.

이제 세포 현탁액을 원심 분리하고 세포 펠릿을 10ml의 신선하고 따뜻한 배양 배지에 재현탁합니다. 혈구 분석기를 사용하여 세포 수를 세고 200만 개의 세포에 대한 부피를 계산합니다. 이제 각 200만 개의 세포 부피를 25cm 정사각형의 배양 플라스크로 옮깁니다.

5 밀리리터의 따뜻한 배양 배지로 준비. 세포를 일주일 동안 5% 이산화탄소로 섭씨 37도로 유지합니다. 더 긴 배양을 위해 일주일에 한 번 배지의 절반을 교체하십시오 배양에서 1-2주 후에 신경구는 일반적으로 200-400미크론 사이의 NSC 직경으로 형성됩니다.

신경구를 단일 세포로 해리하는 것입니다. Hank's medium에서 EDTA로 세포를 15분 동안 배양합니다. 부유 세포를 하대 배양을 위해 준비하려면 스핀 다운하고 행크로 세척하고 따뜻한 배양으로 세포를 보충하십시오. 보통.

분화를 시작하려면 해리된 세포를 poly de lysine에 플레이트화합니다. Laminin 1에 의하여 입힌 덮개는 100, 덮개 당 000의 세포의 조밀도에서 미끄러지고, 미끄러지고 30 분 동안 배양한다. 세포는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte), 뉴런(neuron) 또는 성상세포(astrocyte)로 쉽게 분화될 수 있습니다.

신경 세포 분화를 위해 세포를 B 27과 함께 7일 동안 배지로 유지합니다. 성상세포 분화 배양을 위해 7일 동안 FBS가 있는 배지에 있는 세포. 희소돌기아교세포 분화를 위해 세포를 성장인자와 함께 변형된 배지에 2일 동안 유지하고 2일 후에는 성장인자 없이 동일한 변형 배지를 사용하여 줄기세포를 보관합니다.

해리된 세포 현탁액을 원심분리한 후, 바이알당 1,000만 개의 세포 농도로 동결 배지에서 세포를 현탁시킵니다. 밀리리터당 세포를 섭씨 영하 20도에서 천천히 동결한 후 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 액체 질소로 옮기십시오.

나중에 세포는 섭씨 37도의 수조로 빠르게 해동되고 다시 현탁됩니다. 따뜻하게 데운 D-M-E-M-F 12 플러스 10%세럼으로 세안합니다. 그런 다음 가열된 세포를 원심분리하고 흡인하여 가열된 배양액에 재현탁시킵니다.

정상 태아의 중간 신경 줄기세포. 재태 연령 18주에, GFP로 transfection된 neurospheres를 형성하기 위하여 배양되었다. 신경구는 여러 세포 유형을 만들기 위해 분화한 다음 세포 마커와 반추형으로 고정하고 염색했습니다.

다중 전위는 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포를 나타내는 마커의 발현으로 관찰됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 버려진 전두엽 피질 조직에서 인간 신경 줄기 세포를 분리, 확장 및 조작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 영역은 인간 피질 환경 질병 최대치를 연구하고 약물 치료제의 잠재적 효능을 테스트할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다.