Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

L’objectif global de cette procédure est de quantifier l’absorption de nanoparticules dans les tumeurs à l’aide de l’imagerie intra-vitale. Ceci est accompli en décortiquant et en cultivant d’abord des embryons d’oiseaux. La deuxième étape consiste à établir des tumeurs xénogreffes dans la membrane chorio-électrique ou cam, et à les laisser se développer pendant environ une semaine.

La troisième étape de la procédure consiste à injecter par voie intraveineuse des nanoparticules dans la caméra et à effectuer une imagerie confocale intravitale en temps réel de la tumeur xénogreffée. La dernière étape de la procédure consiste à exciser et à sectionner la tumeur. En fin de compte, l’absorption de nanoparticules par la tumeur est quantifiée à partir des images et une analyse secondaire de la tumeur peut être effectuée.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet de générer des images à haute résolution pour évaluer la dynamique des accumulations de nanoparticules dans les tumeurs au niveau microscopique. De plus, en utilisant ce système modèle, il est possible pour un seul chercheur d’analyser un très grand nombre de groupes expérimentaux en deux semaines. De plus, la membrane alloïde Cory des embryons de Shells est facilement accessible pour la manipulation physique et l’imagerie non invasive.

Mon laboratoire se concentre sur le développement de nanoparticules pour l’imagerie moléculaire ciblée et l’administration de médicaments dans le cancer. Notre recherche d’un modèle de xénogreffe rapide et peu coûteux dans lequel effectuer des analyses détaillées de l’absorption nous a conduits à l’embryon de poulet à coquille. Ici, nous utilisons l’imagerie intravitale à haute résolution pour évaluer l’absorption de nanoparticules dans les xénogreffes de tumeurs humaines dans un modèle d’embryon de poulet à coquilles modifiées.

Pour ce protocole, préparez, liste de coquilles d’embryons de poulet fécondés au quatrième jour. En utilisant la méthode standard, assurez-vous que les embryons sont fécondés et viables en vérifiant qu’il y a un battement de cœur et incubez-les à 38 degrés Celsius avec au moins 60 % d’humidité relative jusqu’à ce qu’ils soient embryonnaires. Le neuvième jour, les embryons sont alors prêts pour l’inoculation des cellules tumorales.

Assemblez un micro-injecteur en connectant une aiguille de calibre 18 à une seringue d’un millilitre avec un morceau de tube tigon de cinq à six pouces. Insérez soigneusement le biseau de l’aiguille dans le tube. Environ quatre à cinq pouces de tube doivent s’étendre à partir de la pointe de l’aiguille.

Maintenant, aspirez la suspension de cellules tumorales à travers le tube dans la seringue et inversez. Tapotez délicatement le côté de la seringue et appuyez sur le piston pour éliminer les bulles d’air. Ensuite, insérez une aiguille en verre de micro-injection à l’extrémité du tube et appuyez sur le piston jusqu’à ce que la suspension cellulaire atteigne la pointe de l’aiguille.

Maintenant, sous un microscope de dissection, injectez lentement et soigneusement 10 000 à 100 000 cellules cancéreuses dans l’espace interstitiel à l’intérieur de la caméra. Les cellules doivent former un bolus visible à l’intérieur de la came, les cellules déposées sur la surface de la came peuvent être retirées en tamponnant légèrement avec une lingette kim ou un applicateur en coton. Maintenant, remettez les embryons dans un incubateur à 38 degrés Celsius avec au moins 60 % d’humidité.

Laissé la tumeur se développer et se vasculariser jusqu’à sept jours, atteignant un diamètre d’au moins cinq millimètres avant l’imagerie, les nanoparticules doivent être marquées avec un colorant fluorescent, compatible avec le microscope intravital et stockées à quatre degrés Celsius dans du PBS où elles sont stables pendant au moins un an. Ensuite, faites tourner les nanoparticules pendant une minute pour granuler les agrégats avant d’être aspirées dans le micro-injecteur. Maintenant, en utilisant le PBS pour diluer les nanoparticules, préparez une concentration de travail d’un milligramme par millilitre pour finalement injecter 50 microgrammes de nanoparticules dans un volume de 50 microlitres.

Procédez maintenant aux injections au 16e jour du développement embryonnaire. Vérifiez que les tumeurs sont suffisamment vascularisées pour sélectionner les meilleurs embryons porteurs de tumeurs par voie intraveineuse. Injecter spectralement une dextrine fluorescente de faible poids moléculaire, distincte des cellules tumorales et des nanoparticules.

Visualisez ensuite la dextrine au microscope fluorescent et sélectionnez les embryons avec les tumeurs les plus vascularisées. Une fois les embryons sélectionnés, utilisez un micro-injecteur préparé pour déposer au moins 200 microlitres de nanoparticules préparées. Retournez la seringue.

Tapotez délicatement le côté et appuyez sur le piston pour éliminer les bulles d’air. Maintenant, insérez une longue aiguille de micro-injection de verre conique dans l’extrémité du tube et appuyez sur le piston jusqu’à ce que la solution de nanoparticules atteigne la pointe de l’aiguille. Une aiguille émoussée ne transpercera pas l’ectoderme et une aiguille trop pointue et fine se brisera lorsqu’elle sera insérée dans le tissu.

Ensuite, par voie intraveineuse, injectez entre 30 et 200 microlitres de nanoparticules dans les embryons distaux du côté souhaité pour être visualisés immédiatement après l’injection de l’image des nanoparticules. Les tumeurs décrites dans la section suivante commencent par la préparation de l’unité d’imagerie embryonnaire. Tout d’abord, appliquez une fine couche de graisse sous vide autour de la circonférence de l’orifice d’imagerie sur la face inférieure du couvercle.

Installez ensuite un couvercle en verre de 18 millimètres sur le port. Maintenant, chargez l’embryon dans l’unité de manière à ce que la lamelle soit au-dessus de la zone souhaitée pour l’imagerie. Abaissez lentement le couvercle de l’appareil jusqu’à ce que la lamelle entre en contact avec l’embryon et vissez le couvercle en place.

Remplissez maintenant la boîte contenant l’embryon dans l’unité d’imagerie avec de l’eau à 37 degrés Celsius. Cette unité maintiendra l’embryon en place sous le microscope confocal à disque rotatif au microscope confocaux à fluorescence à disque rotatif. Vérifiez que la chambre climatique est à 37 degrés Celsius.

Maintenant, positionnez l’unité d’imagerie sur la platine de manière à ce que la fenêtre de recouvrement se trouve directement sous le microscope. Objectif et procéder à l’imagerie. Acquérir des piles d’images à haute résolution de la tumeur et du système vasculaire environnant immédiatement après l’injection et à intervalles d’une heure.

Par la suite, les images refléteront les changements structurels détaillés qui se produisent dans le système vasculaire de la tumeur. L’embryon peut être imagé en continu jusqu’à 36 heures sans qu’il soit nécessaire de changer le bain-marie. Pour quantifier l’absorption de nanoparticules virales à partir des images, utilisez un progiciel tel que la vitesse.

Tout d’abord, sélectionnez la tumeur et délimitez-la à partir du stroma environnant. La sélection est facilitée par le marquage de la tumeur avec de la dextrine fluorescente. Calculez maintenant le signal fluorescent moyen des nanoparticules dans la tumeur et dans les zones représentatives du stroma adjacent.

Ensuite, calculez le rapport du signal moyen. Renforcer la sélection tumorale au signal moyen. Renforcer la sélection stromale.

Un rapport supérieur à un indique que les nanoparticules sont préférentiellement localisées dans la tumeur. Des cellules cancéreuses du côlon HT 29 ont été injectées pour former un bolus d’environ un millimètre de diamètre dans la came du neuvième jour. Après sept jours d’incubation, des embryons de poulet ont été injectés par voie intraveineuse avec une dextrine de faible poids moléculaire pour confirmer la vascularisation de la tumeur.

L’administration intraveineuse de nanoparticules CPMV LOR 6 47 ou pegylées CPMV LOR 6 47, suivie d’une imagerie confocale en temps réel à haute résolution, a révélé que les nanoparticules CPMV et CPMV pégylées marquaient rapidement l’ensemble du système vasculaire. Dans les 12 heures suivant l’injection, la quantification du signal fluorescent dans les régions tumorales par rapport au stroma a révélé que l’absorption du CPMV pégylé dans la tumeur était environ trois fois plus élevée que celle du CPMV. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une imagerie intravitale à haute résolution pour évaluer l’absorption de nanoparticules dans les xénogreffes tumorales dans un modèle d’embryon aviaire, de la préparation des embryons aviaires à la greffe de cellules tumorales, à l’injection intraveineuse de nanoparticules et à l’évaluation de l’absorption de nanoparticules dans les tumeurs par imagerie confocale intravitale en temps réel.