La transfección de anticuerpos en neuronas como una herramienta para estudiar la patogénesis de enfermedades

El objetivo de este procedimiento es proporcionar un enfoque rápido y reproducible para investigar cómo los anticuerpos, los mecanismos automoleculares se relacionan con la función neuronal y la patogénesis de la enfermedad neurológica. Los primeros anticuerpos se marcan con una etiqueta fluorescente ATO five 50 NHS. A continuación, los anticuerpos se mezclan con el reactivo de transfección y luego se transfectan en células neuronales.

En cultivo, 48 horas después de la transfección, las neuronas se fijan con medios DPI y se visualizan mediante microscopía de inmunofluorescencia. La eficiencia de la transfección se puede calcular utilizando un software de imágenes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia y neuroinmunología, como cómo los autoanticuerpos alteran los mecanismos moleculares relacionados con la función neuronal y la patogénesis de la enfermedad neurológica mediada por el sistema inmunitario.

Primero tuvimos la idea de este método cuando quisimos probar la hipótesis de que los anticuerpos contra h y RPA uno y la proteína de unión al ARN sobreexpresada en las neuronas contribuían al mecanismo de neurodegeneración demostrando el procedimiento será Josh Douglas, un estudiante graduado antes de comenzar el procedimiento. Asegúrese de que las células neuronales intactas de alta calidad con placas de 100.000 células por pocillo y al menos el 80% de cofluente estén disponibles el día antes de los experimentos. El día del ensayo observe las células para asegurarse de que están sanas.

Comience preparando un tampón de bicarbonato de sodio de 0,1 mil mezclando 8,4 gramos de bicarbonato de sodio y 29,2 gramos de cloruro de sodio en un litro de agua. A continuación, ajuste el pH del tampón de 8,4 a 500 microlitros de tampón. Agregue 70 microlitros del anticuerpo a transfectar en este caso, anti H-N-R-N-P-A uno y 35 microlitros del reactivo de marcaje aquí en oh five 50 NHS.

Gire la solución a temperatura ambiente durante una hora, luego inyéctela en un dializador y dialize en dos litros de PBS a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, use una columna de centrifugación para concentrar el anticuerpo marcado con dializado. Por último, determine la concentración de anticuerpos utilizando un espectrofotómetro NanoDrop.

En un portaobjetos de ocho pocillos, se observan 10.000 células por pocillo en un volumen de 500 microlitros de DMEM completo. Incubar las células a 37 grados centígrados durante la noche o hasta que la fluidez de la célula alcance al menos el 70% una vez que las células tengan el 70% de cofluidez. Comience el procedimiento mezclando dos microlitros de anticuerpo, administrando los reactivos de transfección y dos microgramos de anticuerpo marcado a 0,5 microgramos por microlitro en un einor e incube la solución durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.

Mientras tanto, retire el SUP natum de los pocillos de cultivo celular y reemplácelo con exactamente 394 microlitros por pocillo, un medio fresco. Una vez que la solución de transfección esté lista, agregue 100 microlitros de DMEM y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, se añaden exactamente 106 microlitros de mezcla de transfección a cada pocillo que contiene células para obtener un volumen final de 500 microlitros por pocillo.

Asegúrese de incluir un pocillo de control negativo UNT TRANSFECTED en el que se agregue DMEM en lugar de anticuerpos. Incubar las células durante 48 horas a 37 grados centígrados. Después de esta incubación, reemplace el medio con DMEM fresco, realice imágenes en vivo con un microscopio fluorescente 48 horas después del etiquetado.

Para visualizar los anticuerpos marcados con ATO five 50 NHS, use el filtro SI tres después de que las imágenes en vivo aspiren el medio y fijen las células agregando 4% de paraldehído e incubando el portaobjetos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Una vez fijadas las células, lávelas cuatro veces en PBS, permitiendo un período de incubación de cinco minutos en PBS para cada lavado. A continuación, retire el PBS y añada una gota de medio de montaje que contenga DPI.

A cada uno, coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior de las células con un microscopio fluorescente. Comience a obtener imágenes de las células. En este experimento, realizamos imágenes de células fluorescentes vivas de neuronas transfectadas con éxito con ATO cinco 50 anticuerpos anti H-N-R-N-P-A one marcados con NHS.

Esta imagen muestra los anticuerpos dentro de las células neuronales, incluidos los procesos neuronales del citoplasma, así como la fijación del núcleo y la tinción del núcleo. El uso de DPI que se muestra aquí en azul permite determinar la eficiencia de la transfección dividiendo el número de células transfectadas por el número de células totales. En este caso, la eficiencia es del 50%siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la inmunocitoquímica, el ARN, la extracción, el análisis de microrrayos y las transferencias occidentales para responder a preguntas adicionales, como la colocalización de anticuerpos dentro de los orgánulos celulares, así como los cambios en la función e integridad neuronal relacionados con la especificidad del anticuerpo para el antígeno diana. En este vídeo, hemos mostrado cómo marcar anticuerpos con una marca fluorescente, preparar un complejo de reactivo de transfección con anticuerpos marcados con fluorescencia, transfectar neuronas y calcular la eficiencia de la transfección. Este método es útil en la evaluación de cómo los autoanticuerpos afectan a las funciones celulares como la viabilidad, la apoptosis, el transporte neuronal, así como a los mecanismos moleculares relacionados con la función neuronal y la patogénesis de las enfermedades neurológicas.