애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

이 절차의 전반적인 목표는 온전한 애벌레 얼룩말 물고기의 전뇌에서 세포 외 필드 기록을 얻는 것입니다. 이것은 먼저 aros 블록에서 애벌레 얼룩말 물고기를 고정시킴으로써 수행됩니다. 다음으로, 기록 마이크로 전극을 전뇌에 배치하여 직접 시각화합니다.

마지막 단계는 전뇌의 전기적 활동을 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 손상되지 않은 제브라피시 유충에서 비정상적인 전기 발작 활동을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 제가 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올린 것은 앞서 설명한 표준 절차를 따르는 제브라피시 사육이 유충 제브라피시에서 발작을 유발할 수 있다는 것을 입증하려고 했을 때였습니다. 간단히.

성체 제브라피쉬는 칸막이가 있는 번식 탱크에 설치됩니다. 다음날 아침에 방의 불이 켜지면 칸막이가 제거되고 물고기가 20 분에서 60 분 동안 방해받지 않고 짝짓기를 할 수 있습니다. 그런 다음 탱크에서 알을 모아 달걀 물과 함께 페트리 접시로 옮기고 이송 피펫으로 파편을 제거한 다음 이제 알을 인큐베이터에 넣고 약 2 일 후에 알이 부화합니다.

부화하면 이송 피펫으로 코리온과 기타 파편을 제거한 다음 원하는 발달 시점에 도달할 때까지 유충을 인큐베이터로 되돌립니다. 준비 과정에서 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 1.2mm 외경의 규산염 보 유리 모세관을 바늘로 당깁니다. 바늘을 퍼티 경사로 위의 150mm 페트리 접시에 보관하십시오.

이제 포장하고 마이크로 전극에 두 개의 몰 염화나트륨 용액을 로드합니다. 4mm 주사기 필터와 부착된 필라멘트가 있는 1리터 주사기를 사용하여 기포가 거의 또는 전혀 남지 않을 때까지 바늘 끝 근처의 덩어리를 두드립니다. 달걀 물에 1.2%LMP 한천을 섞은 신선한 용액을 준비하고 섭씨 37도의 수조에서 녹여 보관합니다.

다음으로, 적절한 녹음 챔버가 있는 커버 슬립을 준비하고 5-10분 동안 냉동실에 넣습니다. 이 예에서는 깨끗한 페트리 접시 플레이트에 있는 로우 프로파일 개방형 다이아몬드 수조 이미징 챔버를 사용하여 전사 피펫을 사용하여 유충 해브라 한 마리, 물고기를 달걀 물방울에 담그십시오. 다음으로, 마취제와 마비제가 함유된 용액 한 방울을 5-10분 동안 섞습니다.

얼룩말 물고기가 움직임을 잃었는지 모니터링합니다. 그런 다음 냉동실에서 커버 슬립과 녹음실을 제거합니다. 실체 현미경 스테이지에 챔버를 챔버에 놓습니다.

전사 피펫을 사용하여 물 속의 물고기에 몇 밀리리터의 아그로스를 넣고 마이크로 피펫 팁 또는 미세한 무딘 바늘을 사용하여 함께 섞습니다. 물고기의 등쪽 측면이 아그로스 정지 표면에 노출되도록 유충을 배치합니다. 아그로스가 굳어지면 평평한 주걱을 사용하여 유충이 있는 어그로 블록을 전기 생리학 장비에 설치된 기록 챔버로 옮깁니다.

리그에서 2-5밀리리터의 제브라피시 기록 매체를 기록 챔버에 추가합니다. 약물 변경이 필요한 경우 분당 약 1ml의 속도로 기록 용액으로 챔버를 관류하면 산소화가 필요하지 않습니다. 다음으로, 3차원 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 증폭기 헤드 스테이지에 마이크로 전극을 삽입합니다.

로드되면 microm 매니퓰레이터의 이동 및 조정 범위가 양호한지 확인하십시오. 그런 다음 마이크로 전극 팁을 view s에서 높은 현미경의 view무대에서 높은 곳에서 코스 조정을 사용하여 제브라피시 머리 바로 위와 약간 앞 지점으로 내립니다. 마이크로 전극을 제자리에 놓고 ampliifier를 현재 cl에 놓습니다.amp 모드를 선택하고 시야에서 전극을 영점 화합니다.

코스 조정을 사용하여 전극 팁을 내려 전뇌보다 약간 앞에 있는 제브라피시 표면에 닿도록 합니다. 그런 다음 미세 조정 단계를 통해 얼룩말 물고기의 피부에 구멍을 뚫을 때까지 전극 끝을 전진시킵니다. 구멍이 뚫리면 마이크로 피펫이 천천히 가라앉도록 하여 전극을 몇 미크론 전뇌로 전진시킵니다.

이제 aScope 소프트웨어를 사용하여 전기 활동을 기록하십시오. 전류 클램프 모드에서는 10kHz의 샘플링 속도로 데이터를 수집합니다. 이 물고기는 24시간 동안 약물을 투여하고, 2-5밀리리터 용량으로 약물을 첨가하고, 약물이 한천을 통해 얼룩말 물고기로 확산될 때까지 30-45분 동안 기다립니다.

4개의 뇌. 정적 수조 구성이 허용되어 지속적인 관류가 필요하지 않습니다. 이러한 방법을 사용하면 시신경 툼에서 세포 외 기록도 얻을 수 있습니다.

전기 발작과 같은 방전은 수정 후 8일의 전뇌에서 기록되었으며, 제브라피쉬 유충, 큰 진폭의 다중 스파이크 파열은 경련 약물인 40밀리몰 필로카르핀의 목욕 적용에 의해 취소되었습니다. 경련 약물로도 비슷한 폭발이 일어났다. 리톡신은 1밀리몰에 적용됩니다.

수정 후 3일째에 유전자 변형 제브라 피쉬에서 자발적인 폭발 분비물이 관찰되었습니다. 이 동물에서 1-2 세포 단계에서 모르포 올리고뉴클레오타이드 주사를 사용하여 발작 및 자폐증과 관련된 소아 형태의 간질인 결절성 경화증 복합체에 대한 유전자의 발현을 녹다운했습니다. 올바르게 수행하면 이 절차를 30분 이내에 완료할 수 있습니다.