דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי ברחם Electroporation ו בvivo הקרנת פליטת אור

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחור בהצלחה סיכומים אלקטרופוטיים ברחם להמשך ניתוח. זה מושג על ידי הזרקת ה-DNA של המטרה ולאחר מכן ביצוע אלקטרופורציה ברחם עבור האזור הנבחר במוח. העוברים החשמליים מתפתחים בתוך רחם האם ונולדים חיים באופן נורמלי.

הדמיה דו-ממדית משמשת לזיהוי בעלי חיים שעברו אלקטרופוטציה בהצלחה בנקודות זמן מוגדרות לאחר הלידה. לבסוף, האזור הממוקד מאופיין ביתר פירוט על ידי הדמיה תלת מימדית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בחולדות טרנסגניות מקומיות אלה במבחנים התנהגותיים כדי להראות את ההשלכות של הפרעה בהתפתחות הנוירולוגית על התנהגות מבוגרים.

בעוד שאלקטרופופורציה היא טכניקה מבוססת, היא לא הייתה בשימוש נרחב ליצירת בעלי חיים בוגרים טרנסגניים מקומיים. זה נובע בחלקו מהמיומנויות הטכניות הנדרשות, אך גם מחוסר היכולת הנוכחי שלנו לבחור רק עבור גורים שזה עתה נולדו שנולדו בהצלחה. אנו מציגים פתרון לבעיה זו על ידי שימוש בהדמיית ביולומינסנציה חיה in vivo כדי לאפשר הדמיית מהות ביולוגית מוצלחת in vivo של חולדות אלקטרו ניטרליות.

קרני לוציפר מדווחות הגן הוא אלקטרופורציה. ניתן להפעיל זיהוי זוהר על ידי הזרקת לוציפריה כדי לנטר את המיקום המשוער של התאים המדורגים. לאחר מכן זה מאפשר לבחור עבור פיצוצים אדומים שעברו אלקטרופוטציה בהצלחה.

להתחיל לאסוף יחד את החומרים הסטריליים הדרושים לאלקטרופורציה ברחם. לאחר מכן, הכינו את תמיסת ה-DNA המכילה את וקטור המטרה D-N-A-G-F-P, וקטור לוציפראז וצבע ירוק מהיר. תחת הרדמה פלואור ISO חשוף את הרחם כדי לדמיין את העובר להזרקה.

בעזרת מחט זכוכית דקה מזריקים את תמיסת ה-DNA לאחד החדרים הצדדיים של העובר. כדי לפגוע באוכלוסיית תאים של שכבות קליפת המוח העליונות, הניחו אלקטרודה של שבעה מילימטר סביב ראש העובר והניחו את האלקטרודה החיובית מעל החדר עם נטייה רוחבית גבית קלה. בצע את האלקטרופורציה עם אלקטרופורציה של דופק גל מרובע על ידי דריכה על דוושת כף הרגל כדי למקד לתאי ההיפוקמפוס.

הנח את האלקטרודה החיובית בצד הנגדי של החדר המוזרק. לפני האלקטרופוטציה, יש לדלל תחילה מלח נתרן לוציפר ב-PBS לריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר ולעקר על ידי סינון סטרילי. לאחר השקילה החזיקו גור עם הבטן למעלה ומתוח מעט לפני הזרקת הלוציפר כדי להתחיל בהליך ההדמיה.

גורים מוזרקים של לוציפר מורדמים ומונחים במצב שכיבה בתוך מכשיר הספקטרום של איוויס. נדרשות תמונות ביולומינסנציה דו-ממדיות ראשונות כדי לקבוע אילו גורים עברו אלקטרופוציה בהצלחה בעבודה בלוח הבקרה של רכישת Ivis, בחר את מצב ההדמיה הביו-לומינסנט כדי לצלם תמונות עיליות בתחילת המדידה. בדוק את הגדרת הצילום והגדר את ה-binning ל-medium ואת ה-F-stop ל-8 בחר השתמש בגובה הנושא תחת הגדרת המיקוד.

לאחר מכן, הגדר את מסנן העירור כדי לחסום את מסנן הפליטה להיפתח ואת ה-binning לבינוני. יש להגדיר את ה-F-stop ל-1 ואת הבמה רמת או שדה הראייה מוגדרים לתמונה דו-ממדית רוכשת. עם זמן חשיפה לזוהר של 180 שניות, האזורים החשמליים של גורים חיוביים נחקרים עוד יותר על ידי צילום תמונות תלת מימד בעקבות הגדרות של לוציפראז גחלילית.

ראשית, ודא שאפשרות הצילום נבחרה כדי לרכוש תמונה תקורה בתחילת ההדמיה. כדי לסרוק את פני החיה לפני מדידת ביולומינסנציה, בחר באפשרות המבנה עבור גורים עד גיל שבועיים. מסנני הפליטה וזמני החשיפה הבאים נבחרים עקב הירידה בעוצמת האות אצל בעלי חיים מבוגרים, זמן החשיפה גדל עבור שלושת מסנני הפליטה הטובים ביותר בחולדות מעל P 20.

לאחר מכן, הגדר את רמת הבמה כך שתהיה ה-benning לבינוני ואת ה-F stop ל-1 ורכוש את התמונה התלת מימדית. לאחר ההדמיה סמנו את החולדות עם חורי אוזניים ברורים כדי להבדיל אותן זו מזו ולהתאים אותן לתמונות ההדמיה החיה של Ivis. לבסוף, הסר את החיה למשטח מחומם עד להתאוששות מלאה.

תמונות תלת מימד נוצרות באמצעות תוכנת התמונה החיה המותקנת מראש במערכת הספקטרום של Ivis. השלב הראשון הוא שחזור טופוגרפיית פני השטח. כדי לעשות זאת, חתוך אזור עניין והגדר את הסף בין 20 ל-30%התחל שחזור תלת מימד של DLIT עבור רקמת מוח עם סף תמונה של 10% עבור כל הגדרת אורך גל.

ליצירת סרטי תלת-ממד, בחרו בלחצן הנפשה בסרגל הכלים 'תלת-ממד', שנו את הכיוון והזום של התמונה התלת-ממדית כרצונכם. לאחר מכן, לחץ על כפתור ההקלטה כדי לעקוב אחר המעבר ממיקום או כיוון אחד למשנהו. בדוגמאות אלה, שבע חולדות P שצולמו לאחר הזרקה לוציפריאנית לא הראו אות זוהר, אות חלש או אות זוהר חזק בהתאם להצלחת האלקטרופורציה.

תמונות אלה מציגות ציר זמן של מדידות ביולומינסנציה עוקבות באותה חולדה המדגימות חלון זיהוי ארוך. כאן תמונות דו-ממדיות מראות אלקטרופורציה מוצלחת לתוך קליפת המוח או ההיפוקמפוס. האזורים הממוקדים מומחשים עוד יותר באמצעות הדמיה תלת מימדית הן בבעלי חיים אלקטרופוטיים בקליפת המוח והן בבעלי חיים בהיפוקמפוס.

סרטון זה מציג את האזור החשמלי בהצלחה ממספר נקודות מבט. בדוגמה זו, המיקומים הממוקדים שזוהו מהדמיה דו-ממדית ותלת-ממדית בבעל חיים מאומתים עוד יותר באמצעות זיהוי ביולומינסנציה ו-GFP epi fluorescence במוח המנותח. תמונה זו שצולמה מאותו מוח של חולדה שאושרה בהצלחה מראה תצוגה מפורטת של תאים המבטאים את ה-GFP ב-P 14 כאשר היא מבוצעת כהלכה.

שיטה זו מאפשרת לחקור את ההשלכות ההתנהגותיות והנוירופתולוגיות של פגמים נוירו-התפתחותיים. בחירה רק בחולדות המדורגות בהצלחה מפחיתה מאוד את העלויות והמאמץ. הצלחה בטכניקה זו דורשת תרגול ויש לה שיעורי תנועתיות ויעילות משתנים.

היסטולוגיה אימונונית של GFP אלקטרו ליבה חשובה לתיעוד האזור המדויק של טרנספקציה ברזולוציות אנטומיות לתיקון פוסט-הוק של תוצאות התנהגותיות.