Analisi delle Targeted proteina virale nanoparticelle distribuito HER2 + Tumori

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare e analizzare la somministrazione sistemica in vivo della nanoparticella mirata al tumore HeroX utilizzando l'imaging ottico multimodale. In primo luogo, la nanoparticella viene iniettata nella vena caudale di un topo portatore di tumore e le immagini a fluorescenza vengono acquisite utilizzando un sistema di imaging ottico multimodale. Dopo l'eutanasia, il tumore e gli organi vengono prelevati e sottoposti nuovamente a imaging per rilevare le particelle fluorescenti all'interno delle cellule tumorali.

Viene quindi eseguita l'imaging confocale in situ. L'analisi delle immagini risultanti dimostra il targeting e la penetrazione quantificabili dei suoi documenti nei tumori dopo la somministrazione sistemica. Uno dei vantaggi delle tecniche di imaging multimodale rispetto alle tecniche esistenti, come la modalità di imaging singolo, è quello di fornire informazioni multiple e complementari che possono migliorare l'analisi e la quantificazione della somministrazione tumorale.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della somministrazione di farmaci, ad esempio se un farmaco mirato non solo viene somministrato ai tumori, ma penetra effettivamente nelle cellule tumorali. A dimostrare la procedura saranno il Dr.J Yun Wang, un ex borsista post-dottorato nel mio laboratorio, e Janet Markman, una studentessa attualmente laureata in questo protocollo. Da sei a otto settimane.

Vengono utilizzati nuovi topi portatori di tumori sottocutanei bilaterali di xenotrapianto. Prepararsi alla somministrazione sistemica mescolando una quantità sufficiente di HeroX con soluzione fisiologica sterile per equivalere a 0,2 millilitri di una dose di 0,004 milligrammi per chilogrammo di HeroX per iniezione. Aspirare delicatamente 0,2 millilitri della miscela HeroX in una siringa da insulina da tre cc da 10 cc dotata di un ago da 29 gauge.

Fare attenzione che non ci siano bolle dopo l'anestesia. Iniettare l'intera miscela nella vena caudale dopo l'iniezione. Pizzicare la coda per evitare la perdita di sangue dal sito di iniezione.

Dopo che l'emorragia si è fermata, pulire il sito di iniezione con un tampone sterile e rimetterlo nella gabbia. Ripetere l'iniezione sullo stesso topo per altri sei giorni consecutivi. Una volta al giorno, l'accumulo di fluorescenza di HeroX nei tumori può essere rilevato entro l'ultimo giorno di iniezione.

Settimo giorno, utilizzando un imager multimodale. Le procedure qui impiegano l'uso di un sistema di imaging ottico con intensità di fluorescenza, fluorescenza spettrale, durata e capacità di imaging confocale intravitale. Qui è mostrato il prototipo dell'imager ottico in vivo.

La telecamera raffreddata ad alta sensibilità e le linee laser ad alta potenza incorporate in questo sistema producono immagini a fluorescenza a contrasto più elevato rispetto ai sistemi di imaging ottico commerciali, in particolare per il rilevamento in vivo della fluorescenza della doxorubicina. Attivare l'imager ottico in vivo multimodale nel software. Selezionare un filtro passa-banda di emissione adatto per il rilevamento della fluorescenza della doxorubicina.

Accendere il laser e posizionare un filtro passa-banda di eccitazione sul percorso ottico del laser. Dopo aver anestetizzato un topo nella camera di anestesia con isoflurano, trasferirlo nella camera di imaging dell'imager ottico multimodale in vivo. Posizionare un cono sul naso del topo e aprire il flusso per somministrare l'anestesia continua.

Durante l'acquisizione delle immagini, acquisire immagini a fluorescenza utilizzando un tempo di esposizione compreso tra cinque e 15 secondi. La fluorescenza del suo medico può essere osservata in tumori e organi specifici, tra cui fegato, reni, milza, cuore e muscolo scheletrico prelevati da topi soppressi 24 ore dopo l'ultimo giorno di iniezione. Accendere l'imager ottico in vivo multimodale.

Come prima, posizionare quindi i tumori e gli organi specifici disposti su una capsula di Petri. All'interno della camera di imaging dell'imager ottico multimodale in vivo acquisiscono immagini a fluorescenza dei tessuti utilizzando un tempo di esposizione da cinque a 15 secondi. Quindi ripetere le stesse acquisizioni utilizzando una capsula di Petri vuota, che fungerà da sfondo dopo l'acquisizione.

Esegui l'analisi e l'elaborazione delle immagini, inclusa la correzione dello sfondo o la regolazione del contrasto. L'imaging confocale in situ consente di rilevare e analizzare l'accumulo tumorale della mandria a livello cellulare. Utilizzando un microscopio confocale.

Seleziona la luce laser a 488 nanometri per l'eccitazione della doxorubicina e lunghezze d'onda di emissione da 560 nanometri a 620 nanometri. Per il rilevamento della fluorescenza con doxorubicina, selezionare un obiettivo 40x o 63x e posizionare una goccia di olio da immersione su di esso. Posizionare i tumori del topo eutanasia su una capsula di Petri per evitare la degradazione dei tessuti.

Quindi trasferire i tumori in una camera a T delta per l'imaging confocale. Acquisizione di immagini confocali dei tumori a profondità focali sequenziali con passo di un micron e spessore di 20 micron. Di seguito è mostrato un esempio di immagini acquisite in sequenza lungo l'asse Z.

Genera proiezioni Z di massima intensità delle immagini. Quindi, utilizzando l'immagine J o un programma simile, calcolare le intensità medie di fluorescenza delle immagini di proiezione Z di massima intensità per il rapporto del campo visivo complessivo. L'imaging e l'analisi spettrale metrico consentono la discriminazione tra doxorubicina, fluorescenza e autofluorescenza.

Utilizzando un microscopio confocale a fluorescenza a scansione laser, è possibile acquisire 15 immagini dei tumori trattati e non trattati con HeroX a una profondità specificata nell'intervallo spettrale da 510 a 650 nanometri con una dimensione del passo di 10 nanometri e un'eccitazione a 488 nanometri di luce utilizzando un microscopio confocale Leica SPE. Successivamente, preparare una soluzione 100 micromolari di doxorubicina in soluzione fisiologica. Eseguire l'imaging spettrale della soluzione di doxorubicina 100 micromolari.

Per ottenere la firma spettrale pura della fluorescenza della doxorubicina. Acquisisci la firma spettrale in autofluorescenza dal cubo dell'immagine mediante l'imaging di tumori non trattati. Una volta raccolti tutti i dati, generare firme spettrali di riferimento, eseguire la classificazione spettrale delle immagini ed eseguire il rimescolamento spettrale lineare di tali immagini per ottenere una valutazione quantitativa dell'accumulo nei tumori del suo doc.

Le immagini di fluorescenza confocale sono state ottenute a diverse profondità focali in situ, seguite dalla proiezione Z di massima intensità delle immagini e dall'acquisizione dell'intensità media di fluorescenza dell'immagine proiettata. L'elevata fluorescenza tumorale mostrata in questa immagine è tipica dopo la somministrazione sistemica dei suoi documenti ed è indicativa del suo targeting preferenziale del tumore. La fluorescenza rilevata nel muscolo scheletrico è atipica e può derivare da anomalie nella procedura di iniezione.

Qualitativamente, questa immagine ha uno sfondo basso. Per l'analisi quantitativa, viene eseguita una correzione dello sfondo utilizzando un piatto vuoto, come mostrato qui. L'immagine con correzione dello sfondo risultante ha un segnale di fondo più alto ai bordi dell'immagine rispetto all'originale perché l'immagine di sfondo ha intensità inferiori ai bordi dell'immagine.

Le immagini impilate mostrate a sinistra sono rappresentative delle scansioni confocali del tessuto tumorale ottenute a profondità sequenziali di un micron. L'immagine a destra mostra la raccolta delle immagini impilate a sinistra. L'immagine di compilazione contiene le informazioni sull'accumulo di HeroX sulle profondità Z indicate ad ogni pixel, e quindi la media delle intensità di fluorescenza riflette quantitativamente gli accumuli complessivi di doc della mandria nei tumori a diverse profondità.

Distinguere la fluorescenza del medico di mandria dall'autofluorescenza nei tumori e discriminare quantitativamente le due con metriche ad alto rapporto di specificità. Viene eseguita l'imaging e l'analisi spettrale. Questa immagine mostra le firme spettrali pure per la doxorubicina.

L'intensità di fluorescenza dell'area tratteggiata delineata alle lunghezze d'onda di emissione indicate produce un istogramma che mostra il profilo della doxorubicina nello spettro delle lunghezze d'onda da 510 a 650 nanometri. Qui vengono mostrate le firme spettrali pure per l'autofluorescenza. La fluorescenza emessa da un tumore non trattato alle lunghezze d'onda di emissione indicate produce una pendenza che rappresenta il profilo di emissione dell'autofluorescenza. Riferimento.

Le firme spettrali sono state create anche mescolando diversi rapporti delle firme spettrali pure. Utilizzando il programma, abbiamo sviluppato ogni referenza. La firma spettrale qui rappresenta la fluorescenza relativa dei suoi docks accumulati nei tumori rispetto all'autofluorescenza.

Dopo aver ottenuto le firme spettrali dei dock e l'autofluorescenza, i segnali del dock vengono separati utilizzando l'unmixing spettrale lineare. La figura mostra l'immagine mista dell'autofluorescenza e dei suoi documenti prima dell'unmixing spettrale e l'immagine dei suoi docs separati dopo l'unmixing spettrale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come combinare l'intensità della fluorescenza, l'auto comfort e le modalità di imaging spettrale per migliorare l'analisi e la quantificazione della somministrazione del tumore.

Non dimenticare che lavorare con la doxorubicina può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come doppi guanti e frequenti cambi di guanti.