استخدام كاسباس المتعدد الفحص لتحديد موت الخلايا المبرمج في المهاد الخليوي نموذج

الهدف العام من هذا الفيديو هو إظهار مقايسة متعددة الإرسال عالية الإخراج لتحديد بداية موت الخلايا المبرمج كما تم قياسه بواسطة caspase. ثلاثة سبعة. يتم تحدي الخلايا العصبية تحت المهاد الأولى مع حمض الدهون المشبعة التي تحفز موت الخلايا المبرمج ، حمض البالمتيك.

ثم يتم قياس صلاحية الخلايا العصبية باستخدام كاشف قائم على الفلورسنت وقارئ صفيحة دقيقة بعد ظهور موت الخلايا المبرمج. تضاف الركيزة اللومينو ، DEVD ، وهي عبارة عن تسلسل من الأحماض الأمينية المشقوقة بواسطة الكاسباز ثلاثة ، إلى الخلايا. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في قياس اللمعان باستخدام قارئ صفيحة دقيقة لتحديد نشاط الكاسباز ، والذي يزداد في الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج.

في النهاية ، يمكن الحصول على نسبة نشاط الكاسباز لكل خلايا قابلة للحياة في أقل من خمس إلى ست ساعات. بتنسيق 96 بئر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية لأساليبنا الحالية ، مثل البقع الغربية أو التحلل ، هي أنه اختبار سريع وغير مكلف يمكنه قياس نشاط كاسباز ثلاثة سبعة بشكل مباشر في تنسيقات متعددة للآبار.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في هذا المجال ، مثل تحديد المعدلات الأولية لموت الخلايا المبرمج. تتمثل فائدة هذه التقنية في أنه يمكن استخدام هذا تعدد الإرسال كطريقة دقيقة لتقييم السمية الخلوية وقابليتها للحياة. على الرغم من أن الاختبار بسيط إلى حد ما ، إلا أن العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لأنه سيضمن اكتمال الفحص بنجاح.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتنكس العصبي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أمراض أخرى ونماذج في المختبر مثل تلك المستخدمة في أبحاث السرطان. سيحتاج الأفراد الجدد في هذه الطريقة إلى تحسين هذه التقنية لأن نقاط النهاية تعتمد على خط الخلية وناهض. نشاط كاسباز ثلاثة سبعة عابر.

لذلك ، اعتمادا على فعالية ضغط الخلية ، فإن تحديد التوقيت المناسب لفحص نشاط قاعدة المصبوب يمكن أن يستغرق بعض الجهد للبدء بسرعة. ذوبان الجليد تجميد 12 خلية في حمام مائي 37 درجة مئوية. بمجرد إذابتها ، قم بوضع الخلايا برفق في قارورة مزرعة ذات تهوية بحجم 75 سم مربع وأضف 10 مل من Delcos الدافئة ، أو النسور المعدلة ، أو المتوسطة ، أو DMEM ، واحتضن القارورة طوال الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.

بعد 24 ساعة ، يمكن أن يستمر استنشاق الوسط واستبداله بوسط جديد في نمو الخلايا حتى يتم الحصول على ما بين 70 و 80٪ التقاء بعد يومين إلى ثلاثة أيام من النمو. لحساب الخلايا أولا دافئة DMEM وواحد x تريبسين ، محلول EDTA إلى 37 درجة مئوية. استنشق الوسائط من القارورة واغسلها مرتين بمحلول ملحي معقم بالفوسفات.

أضف 500 ميكرولتر من محلول الترين قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح بين دقيقتين وخمس دقائق. افصل الخلايا عن القارورة باستخدام مكشطة الخلايا في خمسة ملليلتر من الوسائط. مرر الخلايا عبر مصفاة خلوية إلى أنبوب نظيف سعة 50 ملليلترا.

قد يكون من الضروري تمرير الخلايا عبر المصفاة أكثر من مرة ، ولكن لا تكرر أكثر من ثلاث مرات بعد عد الخلايا باستخدام بذرة مقياس الخلوي الدموي. 6 ، 000 خلية لكل بئر في 96 صفيحة سوداء أو بيضاء ذات قاع واضح في حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر من الوسط ، احتضان اللوحة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. نقل حمض البالمتيك إلى قارورة زجاجية معقمة سعة خمسة ملليلتر وقم بالذوبان في DMSO بنسبة 100٪.

بعد تخفيف محلول حمض البالمتيك المرق من واحد إلى 10 في DMSO ، قم بإضافته إلى PREWARM DMEM للحصول على تركيز عمل نهائي يبلغ 0.1 مللي مولار حمض البالمتيك لوسائط التحكم ، أضف نفس تركيز DMSO الذي تمت إضافته إلى الوسائط المحتوية على حمض البالمتيك. قم بإزالة الوسائط الموجودة في كل بئر واستبدلها ب 50 ميكرولتر من حمض التشنج المتوسط زائد أو ناقص ، واحتضان اللوحة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم أضف خمسة كواشف راتينج ميكرولترات ، واحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، وقم بتحميل اللوحة على قارئ Microplate متعدد الأوضاع وسجل التألق بطول موجي إثارة يبلغ 560 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 590 نانومتر.

لقياس مسؤولية الخلية ، يتم تقديم النتائج كوحدات مضان نسبية لنفس اللوحة. أضف 55 ميكرولترا من كاشف الصب DEVD واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. مرة أخرى باستخدام تلألؤ سجل قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس الكاسباز ، يتم تقديم ثلاث نتائج نشاط سبع كوحدات تلألؤ نسبية مع تلألؤ يتناسب طرديا مع الكاسباز ثلاثة سبعة لتطبيع الكاسباز ثلاثة سبعة نشاط لعدد الخلايا ، وتقسيم قابلية الخلية للبقاء على نشاط كاسباز ثلاثة سبعة.

يصف هذا البروتوكول النتائج في تعدد الإرسال اثنين من المقايسين المنفصلين لتحديد آليات موت الخلايا عن طريق موت الخلايا المبرمج. زاد نشاط الكاسباز بشكل ملحوظ في الخلايا التي تواجه تحديا بحمض البالمتيك. بعد حضانة ساعتين ، تتغير سلامة غشاء الخلية بشكل واضح في وجود حمض البالمتيك.

يظهر هنا المسار المحتمل الذي يحفز فيه حمض البالمتيك موت الخلايا المبرمج. يساعد فهم الآليات الأساسية للضغط المستخدم للحث على موت الخلايا المبرمج في تحديد المدة الزمنية لحضانة الضغوط. نظرا لأنه يجب تنشيط إنزيمات الكاسباز قبل التفاعل مع ركيزة DEVD بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من خمس إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء مقايسة نشاط متعدد الإرسال ثلاثة سبعة باستخدام نموذج ثقافة الخلايا العصبية تحت المهاد في المختبر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن أوقات الحضانة تعتمد على أنواع الخلايا والضغوطات أو الناهضات المستخدمة. يسمح تطوير هذه التقنية للباحثين في مجال علم الأعصاب باستخدام تقنية موثوقة وموفرة للوقت لدراسات موت الخلايا المبرمج بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء فحوصات دوائية إضافية تستهدف بروتينات معينة في عملية موت الخلايا المبرمج من أجل تحديد الآليات الأساسية التي تبدأ الأمراض التنكسية.