Fabricação de uma funcionalizados Magnetic bacteriana Nanocellulose com óxido de ferro nanopartículas

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar nanocelulose bacteriana, ou BNC, e torná-la magnética impregnando in situ com nanopartículas de óxido de ferro. As membranas magnéticas BNC são projetadas para atrair localmente e reter células magnetizadas contra o fluxo hemodinâmico. A principal vantagem do BNC magnético sintetizado neste procedimento é que ele fornece um tratamento minimamente invasivo próximo aos aneurismas cerebrais.

Os tratamentos convencionais de aneurismas cerebrais, como clipagem e emulação do núcleo neural e vascular, são invasivos e traumáticos e não são adequados na maioria dos pacientes com riscos aumentados. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças vasculares, porque os enxertos vasculares, feitos de andaimes magnéticos, podem acelerar a cicatrização, melhorando a retenção celular no local da lesão. Inicie este procedimento com a preparação do meio de cultura líquido conforme descrito no protocolo de texto.

Transfira dois mililitros do meio de cultura líquido para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Pegue duas colônias com uma agulha inoculante das placas de Petri inoculadas em etapas e coloque-as no primeiro poço da placa de cultura de tecidos. Repita o mesmo procedimento para os 23 poços restantes.

Incubar a placa de cultura de tecidos a 30 graus Celsius por sete dias. Isso resultará em um total de 24 películas BNC com um diâmetro de 16 mm e uma espessura de aproximadamente 2 a 3 mm. Colete as películas de BNC do meio de crescimento e esterilize-as em 200 mililitros de solução de hidróxido de sódio a um por cento por uma hora a 50 graus Celsius para remover todos os vestígios de G.Xylinus.

Descarte a solução e adicione 200 mililitros de solução de hidróxido de sódio a 1% recém-preparada. Repita o mesmo processo mais uma vez ou até que as hélices de BNC em solução adquiram uma aparência translúcida. Enxágue as películas de BNC com água três vezes e guarde-as em água de alta pureza em temperatura ambiente.

Certifique-se de que as películas BNC estejam completamente submersas na água e não sequem em nenhum momento. Em seguida, autoclave as películas BNC a 121 graus Celsius por 20 minutos. Para iniciar a síntese, borbulhe 1000 mililitros de água de alta pureza com gás nitrogênio para remover qualquer oxigênio dissolvido na água e substitua-o por nitrogênio.

Utilizar um balão de fundo redondo de três gargalos para preparar uma solução numa proporção de 2 para 1 molar de cloreto de ferro 3 hexa-hidratado e cloreto de ferro 2 tetra-hidratado, diluídos com água de alta pureza desoxigenada. Use 2 pescoços do vaso para fornecer uma entrada e saída constantes de gás nitrogênio, conectando o suprimento de gás nitrogênio a uma agulha perfurada em uma rolha de septo e fixada ao gargalo do vaso. Coloque uma película de BNC no recipiente com os reagentes.

Certifique-se de que a amostra esteja completamente submersa no líquido. Em seguida, preencha todas as juntas de vidro com graxa a vácuo. Conecte o gargalo restante do recipiente a um tubo condensador coberto com um tubo de secagem cheio de sulfato de cálcio anidro.

Deixe correr água pelo tubo do condensador. Em seguida, aqueça a solução em um banho de óleo de silicone a 80 graus Celsius, usando uma placa quente de agitação e mantenha essa temperatura. Use uma pequena barra de agitação magnética para misturar os reagentes a 350 RPM por 5 minutos.

Certifique-se de que o BNC esteja adequadamente impregnado com a solução ferrosa e que os reagentes estejam completamente dissolvidos. Aumente a velocidade de agitação para 700 R.P.M.In um intervalo de tempo de cinco minutos, adicione cinco mililitros de hidróxido de amônio aos 10 mililitros de solução ferrosa usando uma agulha de pipetagem que foi perfurada em uma rolha de septo. Após a adição do hidróxido de amônio, a cor da solução muda de amarelo-laranja para preto.

Continue mexendo a solução a 80 graus Celsius por mais cinco minutos. Evite agitações de alta velocidade para manter a integridade da amostra. Abaixe a temperatura da solução para 30 graus Celsius usando a parte inferior de controle de temperatura da placa de agitação e continue mexendo por mais cinco minutos.

Em seguida, desligue a placa quente. Neste ponto, as nanopartículas de óxido de ferro foram incorporadas à malha BNC. Em seguida, resfrie a mistura até a temperatura ambiente e transfira-a para um frasco de recipiente para separar as nanopartículas magnéticas, ou MNPs, e o BNC com um forte ímã permanente.

Para fazer isso, mantenha o ímã próximo ao vaso para manter os MNPs e o BNC no lugar enquanto decanta o sobrenadante. Ressuspenda os MNPs e o BNC em 100 mililitros de água. Agite suavemente a solução para remover todos os MNPs que não estão fortemente incorporados ao BNC.

Em seguida, transvase novamente o sobrenadante, mantendo os MNP e o BNC no lugar com o íman. Lavar várias vezes os MNP e o BNC com água até que o sobrenadante atinja um PH neutro, medido com uma tira colorimétrica. Separe o BNC funcionalizado magnético, ou MBNC, dos MNPs, usando uma pinça, e enxágue os MBNCs várias vezes com água até que a água saia limpa.

Esterilize o MBNC expondo-o durante a noite para U.V.Store o MBNC em 20 mililitros de água desoxigenada de alta pureza que foi autoclavada a 120 graus Celsius por 20 minutos. Assepicamente, mergulhe a amostra em um por cento de polietilenoglicol, ou PEG, e mexa por duas horas em temperatura ambiente. O revestimento com PEG melhora a biocompatibilidade e a estabilidade das nanopartículas de óxido de ferro depositadas no BNC à medida que são distribuídas pela rede MBNC tri-D.

A aparência macroscópica do BNC é mostrada aqui. O vaso de cultura dá a forma das películas. A microscopia eletrônica de varredura revela que fitas finas formam a microestrutura do BNC com aproximadamente 50 nanômetros de diâmetro, que criam poros abertos em toda a rede.

A funcionalização magnética do BNC fornece uma estrutura fibrilar menos compactada em comparação com o BNC. As nanopartículas de óxido de ferro estão preferencialmente localizadas entre os poros formados pelo entrelaçamento de fibrilas. A topografia de microscopia de força atômica detectou o gradiente de força magnética caracterizado por dois domínios na superfície do MBNC.

Um campo magnético de alta intensidade, mostrado em amarelo, e um campo magnético de intensidade fraca, mostrado em verde. A presença de domínios magnéticos observados com MFM é confirmada por dados de magnetômetro de amostra vibratória que mostram que as nanopartículas de óxido de ferro são superparamagnéticas, tornando o BNC magnético. A integridade do DNA nas células do músculo liso aórtico humano é preservada após um período de incubação de 24 horas, quando cultivado na ausência e presença de BNC ou MBNC, como evidenciado quando comparado às células submetidas ao tratamento com peróxido de hidrogênio.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como tornar uma nanocelulose bacteriana magnética para aplicações na reconstrução de vasos sanguíneos danificados. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando precisávamos induzir um gradiente de densidade de nanopartículas magnéticas que precisavam ser dispersas dentro da matriz complexa da rede de nanocelulose bacteriana. A integração das nanopartículas de óxido de ferro nesta rede exigiu que realizássemos um método durante a síntese do BNC.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque há uma série de etapas complexas para impregnar nanopartículas de óxido de ferro em BNC.