在小鼠原代肝细胞测定脂肪酸氧化和脂肪生成的

该程序的总体目标是评估原代小鼠肝细胞中的脂肪酸代谢。这是通过首先灌注小鼠肝脏与消化培养基，将其去除，然后分离肝细胞来实现的。第二步是在胶原包被的平板上培养肝细胞。

接下来，用要测试的实验干预措施处理肝细胞。最后一步是在放射性标记底物存在下孵育细胞。最终，液体闪烁分析用于显示各种药物或遗传干预对原代肝细胞脂肪酸氧化或脂肪生成的影响。

这种方法可以帮助回答代谢和糖尿病领域的几个关键问题，包括特定的药物和遗传干预如何影响肝细胞生物学。这种方法的可视化演示至关重要，原因有两个。第一，影响肝细胞健康的特定灌注条件难以获得，第二，释放二氧化碳的定量。

Gas 并不直观。演示此程序的是我实验室的研究生 Tom Akey。通过将无菌管的一端放入预热的肝脏灌注、培养基中，将另一端放入废液容器中，设置蠕动泵。

运行泵，直到整个管道都充满培养基。在牺牲感兴趣的小鼠后，用 70% 乙醇大量喷洒小鼠腹部。然后用钝头剪刀在真皮、腹部长度处做一个中线切口，并横向反射。

在腹膜上做一个类似的切口，露出内脏。使用钝器轻轻移位肠道。要暴露腹部脉管系统，请找到腹部下腔静脉，并在缝合线远端肾静脉远端的血管下方放置缝合线。

将针头和导管放入下腔静脉并将其推进到缝合线之外。在针头仍在原位的情况下，将缝合线系在导管上以将其固定到位，然后小心地取下针头。如果作正确，血液将使用移液管流过导管。

用灌注介质填充导管中的剩余区域，并确保没有空气。然后非常小心地将管子连接到导管上。接下来，用锋利的尖剪刀小心地刺穿隔膜，并做一个横向切口以露出胸膜腔。

注意避开胆囊和胸膜脉管系统，在肝静脉近端的胸下腔静脉周围放置一个斗牛犬夹。然后切开门静脉，以每分钟 3 到 4 毫升的速度打开泵。使用大约 20 毫升灌注培养基，用肝脏灌注培养基灌注肝脏 5 分钟。

在此期间，观察肝脏的颜色立即从红色变为灰褐色。如果肝脏的某些部分保持红色，则表明灌注不良，成功分离的可能性大大降低。灌注 5 分钟后，停止泵并将管路转移到肝脏消化培养基中。

重新启动泵并再灌注肝脏 10 到 15 分钟。以每分钟 3 至 4 毫升的速度，直到培养基用完。灌注结束时，停止泵。

肝脏应呈粉红色，并显得略微增大。此时，通过仔细解剖切除肝脏。转移到 10 厘米的组织培养皿中，取出胆囊。

接下来，向肝脏中加入 10 毫升电镀培养基，然后开始使用手术刀轻轻刮擦肝脏。要去除肝细胞，请用 100 微米细胞过滤器过滤悬浮液，并将其转移到 50 毫升锥形管中。用额外的 10 mL 电镀介质清洗板，并将液体吸入 50 mL 锥形管中。

然后在 4 摄氏度下沉淀细胞，离心 5 分钟，以 350 Gs 的离心速度吸出培养基，并将细胞沉淀重悬于 10 mL 铺板培养基中。接下来，加入 10 毫升涂有聚乙烯基乙烷酮的 90% 胶体二氧化硅，轻轻混合，然后像以前一样沉淀细胞。离心后，吸出漂浮在混合物顶部的死细胞层。

然后用 20 毫升平板洗涤活沉淀细胞两次。中等复苏。将最终细胞沉淀悬浮在 10 毫升电镀培养基中，并使用血细胞计数器对细胞进行计数，将每孔 90， 000 个细胞放入涂有胶原蛋白的 24 孔培养皿中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育板 2 小时，在开始测定前 16 至 20 小时。

用温热的 PBS 洗涤细胞两次，然后将细胞改为无血清血清饥饿。含有 20 纳摩尔胰高血糖素的培养基。在测定的早晨，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。

准备预孵育培养基，然后更换血清饥饿。培养基 用于预孵育培养基。在孵育过程中，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的混合物中孵育两小时。

孵育结束前约 15 分钟，通过在氮气下蒸发乙醇溶剂，每孔 0.5 微居里 C 14 棕榈酸酯，以 12.5 微升/微居里浓度重悬 C 14 棕榈酸酯在 0.1 中。普通氢氧化钠将混合物在 70 摄氏度下孵育 10 分钟。然后加入 3 体积的温热预孵育液、培养基，并通过上下吹打混合。

轻轻摇动板，在每个孔中加入 25 μL 稀释的 C 14 棕榈酸酯混合物，并在 37 摄氏度下孵育 90 分钟。这是检测板 在孵育过程中，从无菌的 24 孔板上取下盖子，并在每个孔的底部放置一张 2 厘米 x 2 厘米的滤纸。然后使用一个大的矩形物体（如微型移液器吸头盒）用一块尺寸为 4 英寸 x 7 英寸的参数覆盖板。

孔上摩擦多开形状，在孔口处穿孔多开形状，并在板的其余部分形成密封。然后去除香水的穿孔圆圈。现在，在孵育结束前 10 分钟覆盖孔，向滤纸板的每个孔中加入 200 微升三种正常氢氧化钠，确保滤纸吸收所有液体。

在孵育快照结束时，将检测板在液氮中冷冻。接下来，向检测板的每个孔中加入 100 微升 70% 的热量酸。立即用滤纸板盖住，并将板放在定轨振荡器上。

在室温下以 80 RPM 的轨道速度摇动板 2 小时。然后通过将滤纸方块转移到闪烁瓶中的 4 毫升液体闪烁液中来测量二氧化碳分数，并在闪烁计数器上测量 C 14 信号以测量酸溶性材料。将 400 μL 培养基以最大速度转移到 1.5 mL 微量离心管离心机 10 min，然后将 100 μL 所得上清液加入 500 μL 氯仿和甲醇的二比一混合物中。

短暂涡旋混合物，然后向混合物中加入 250 微升水并涡旋。同样，将样品以 1000 Gs 离心 10 分钟，然后将 200 μL 上层相转移到闪烁瓶中的 4 mL 液体闪烁液中，并测量细胞血清饥饿后的 C 14 信号。将细胞更换为脂肪生成培养基。

添加任何要测试的感兴趣化合物，然后在孵育期后将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 2 小时。用 PBS 洗涤细胞两次，然后加入 120 μL 0.1 正常盐酸裂解细胞。对于每个，充分刮擦孔以释放裂解物，然后将 100 微升裂解物移液到 1.5 毫升微量离心管中。

接下来，向每个试管中加入 500 微升氯仿和甲醇的二比一混合物。短暂涡旋，然后在室温下孵育 5 分钟。在 250 μL 水涡旋中孵育后，然后在室温下将样品再孵育 5 分钟。

然后以 3000 Gs 离心样品 10 分钟，小心地将分离液体的下相转移到闪烁瓶中的 4 毫升液体闪烁液中，并使用闪烁计数器测量氚活度。该程序通常导致每只小鼠分离 10 至 3000 万个肝细胞。孵育过夜后，健康细胞呈六边形，其中许多细胞将成核。

不健康的培养物通常含有颗粒或气泡，这表明细胞死亡。这里显示了脂肪酸氧化测定的结果，其中添加了 F-C-C-P-A 细胞呼吸促进子和寡霉素（一种呼吸抑制剂）与载体对照进行比较，以测量完全氧化。计算二氧化碳与酸溶性材料的比率。

促进细胞呼吸的物质（如 FCCP）会将该比例转变为二氧化碳，表明通过 TC 进行更多氧化。呼吸链的循环抑制剂在测量时会总体上减少氧化。对于脂活性化合物，与载体对照相比，增强脂肪酸氧化（如 FCCP）或减少 TP 合成（如寡霉素）的化合物将降低培养肝细胞中的脂活性。在尝试此程序时，重要的是要确保在动物宰杀后完全及时地进行大量繁殖。

此外，在脂肪酸氧化测定过程中，培养基的完全冷冻对于二氧化碳气体的可重现测量至关重要。看完这个视频，你应该对如何分离原代肝细胞以及使用这些细胞在体外分析脂肪酸氧化和脂肪生成有了很好的了解。