Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti

L'obiettivo generale del seguente protocollo è quello di generare il cancro alla prostata. Xenotrapianto derivato da cellule tumorali circolanti. Ciò si ottiene prelevando prima il sangue periferico da pazienti con carcinoma prostatico avanzato.

In una seconda fase, viene isolato il compartimento delle cellule mononucleate del sangue, che contiene le cellule tumorali circolanti. Successivamente, le cellule mononucleate vengono colorate con un anticorpo CD 45 ZI Al fine di selezionare le cellule tumorali circolanti utilizzando la citometria a flusso, le cellule vengono quindi iniettate in topi immunocompromessi. I risultati mostrano la generazione di xenotrapianti di cancro alla prostata basati sull'iniezione di cellule tumorali circolanti isolate mediante citometria a flusso dal sangue periferico di pazienti con cancro alla prostata.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro alla prostata generando nuovi modelli sperimentali che possono essere utilizzati per la caratterizzazione molecolare del cancro alla prostata e lo sviluppo di nuovi biomarcatori. A dimostrare la procedura saranno Williams, uno studente del laboratorio e Omada, un ricercatore del dipartimento di oncologia qui al Mount Sinai per iniziare a raccogliere sangue intero da pazienti selezionati con carcinoma prostatico metastatico in quanto hanno il potenziale per avere un numero elevato di cellule tumorali circolanti nel sangue periferico. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, trasferire il sangue intero in una provetta conica di polistirene da 50 millilitri, insieme alla soluzione salina di Hank's.

In un rapporto uno a uno, pipettare delicatamente la miscela per omogeneizzarla. Quindi, aggiungere 15 millilitri di una soluzione di call pack FI a un tubo conico vuoto di polistirene da 50 millilitri. Pipettare delicatamente 20 millilitri di sangue intero diluito, utilizzando l'impostazione più bassa sopra la soluzione per formare uno strato superiore distinto.

Quindi centrifugare la provetta a 400 Gs per 30 minuti. A temperatura ambiente, impostare la decelerazione della centrifuga al minimo per evitare la miscelazione delle soluzioni dopo la separazione. Dopo la centrifugazione, identificare la sottile striscia bianca e grigia delle cellule mononucleate del sangue periferico e delle cellule tumorali circolanti inserite tra lo strato superiore del plasma e la soluzione di separazione.

Nella parte inferiore della provetta, raccogliere con cura le cellule dalla striscia bianca grigia e trasferirle in una provetta di polistirene da 50 millilitri. Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, aggiungere quella di Hank. Bilanciare la soluzione salina nelle celle isolate per un volume totale di 10 millilitri.

Centrifugare nuovamente il composto a 400 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Per lavare le cellule, rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio. Fate un passo ancora una volta.

Dopo il secondo lavaggio, scartare il surnatante. Sospendi il pellet rimanente in cinque millilitri di tampone per lisi dei globuli rossi e incuba la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, centrifugare il campione a 400 Gs per tre minuti a temperatura ambiente e rimuovere il tampone di lisi scartando il surnatante.

Infine, risospendere il pellet in un millilitro di PBS integrato con il 10% di siero fetale bovino prima della colorazione. Quantificare il numero di cellule vitali utilizzando il metodo standard di esclusione trian blue su un emometro, citometro o contatore di cellule automatizzato. Quindi diluire le cellule a 1 milione di cellule per millilitro in PBS con il 10% di FBS e metterle in ghiaccio per un'ora.

Per bloccare il legame aspecifico, distribuire la sospensione cellulare in due tubi separati. Etichettare una provetta per le cellule di controllo e una per le cellule di colorazione CD 45 nella provetta di controllo. Aggiungere IgG un Kappa Zi a una diluizione da uno a 250 fino a una concentrazione finale di 10 nanogrammi per millilitro.

Nel tubo di colorazione CD 45. Aggiungere l'anticorpo primario coniugato CD 45 ZI alla stessa concentrazione di 10 nanogrammi per millilitro e incubare le sospensioni cellulari su ghiaccio per 30 minuti. Quindi, centrifugare le celle a 400 Gs per tre minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare lo snat.

Lavare le celle due volte sospendendo ogni pellet in PBS sterile integrato con il 10% di FBS seguito da centrifugazione a 400 Gs per tre minuti a quattro gradi Celsius. Dopo il lavaggio resus, sospendere le cellule in una soluzione da un millilitro di PBS contenente 10 microgrammi per millilitro di colorante dappy. Filtrare la soluzione finale attraverso cappucci filtranti da 35 micrometri in tubi di polistirene da 12 mm per 75 millimetri per escludere eventuali grumi o detriti cellulari.

Quindi escludere le cellule positive CD 45 e le cellule morte dalla sospensione utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per rimuoverle come descritto nel protocollo di testo allegato. Mescolare la sospensione di cellule tumorali prostatiche selezionate con le proteine della matrice extracellulare in un rapporto di uno a uno e posizionare la miscela sul ghiaccio. Successivamente, anestetizzare la bocca di un maschio immunodeficiente di 8-10 settimane in conformità con le linee guida istituzionali utilizzando il 5% di isofluoro inalato in un litro al minuto di ossigeno.

Garantire un'anestesia appropriata controllando la perdita del riflesso corneale e delle dita dei piedi nel topo. Aspirare 250 microlitri di sospensione cellulare utilizzando un ago da 25 gauge e una siringa da un millilitro. Quindi iniettare l'intero volume della sospensione cellulare della matrice extracellulare per via sottocutanea in entrambi i fianchi superiori dei tumori del monitor del topo eseguendo la palpazione settimanale dei siti di iniezione del topo per la crescita delle densità nodulari sottocutanee.

Sulla base del metodo di selezione negativa utilizzato in questo protocollo, è necessario escludere le cellule morte utilizzando la colorazione DAPI. Come mostrato qui, la percentuale di cellule CD45 negative dalle restanti cellule vitali è variabile e dipende dal carico tumorale del paziente, ma sono facilmente separabili dalle cellule CD45 positive. Quando viene utilizzato un gating appropriato, dopo l'impianto della sospensione di cellule tumorali della prostata, le densità nodulari sottocutanee diventeranno visibili su entrambi i fianchi del topo.

Ogni densità nodulare rappresenta la crescita dello xenotrapianto e può essere apprezzata come distinta dal tessuto sano in quanto sporge dalla muscolatura dorsale del topo ed è di consistenza più solida. I modelli di xenotrapianto derivati da pazienti generati da cellule tumorali circolanti ricapitolano i tumori della prostata umana come visto dalla colorazione di emato, toina ed eosina e dall'immunoistochimica per marcatori cellulari specifici della prostata come il recettore degli androgeni e l'antigene di membrana specifico della prostata Dopo aver generato gli xenotrapianti. Altri protocolli come la profilazione dell'espressione genica o proteica possono essere eseguiti per esplorare i meccanismi cellulari e molecolari che contribuiscono all'aggressività del cancro alla prostata.