머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

이 실험 절차의 전반적인 목적은 두경부 편평세포암(head and neck squamous cell carcinoma) 또는 HNSCC 세포주로부터 암 줄기세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 종양의 방사선 저항성을 극복하기 위해 화학요법을 어떻게 활용할 것인가에 대한 암 치료 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마커의 조합을 사용하여 HNSCC 세포주 유래 암 줄기세포에 대해 높은 특이성을 확보한다는 점입니다.

시연 절차는 기술자인 Prescillia Battiston-Montagne과 저희 연구실의 박사인 Marion Gilormini가 진행하겠습니다. Hoechst 염료 유출 분석법으로 암 줄기세포 유사 세포의 사이드 팝업(side population)을 선택하려면, 먼저 원추형 튜브 하나에는 Hoechst라고 표시하고, 다른 하나에는 Hoechst and Verapamil이라고 표시하십시오. 그다음, HNSCC 세포 배양물을 멸균된 PBS로 세척한 후 1 mL의 Tripsyn EDTA를 첨가하십시오.

37°C에서 3분 후, 신선한 세포 배양 배지를 사용하여 반응을 중단시키고 세포 수를 측정합니다. 배양액을 mL당 1×10⁷ cells로 희석하고 모세포주 배지를 채웁니다. 그 다음 Hoechst 및 Verapamil 튜브에 100 µL를 추가하고, Hoechst 튜브에 세포 4 mL를 추가합니다.

다음으로, 10 µL의 5 mM Verapamil hydrochloride 용액을 Hoechst 및 Verapamil 샘플에 조심스럽게 혼합한 후, 두 튜브 모두에 세포 1 × 10⁶개당 5 µL의 Hoechst를 첨가합니다. 그 후 샘플을 알루미늄 호일로 감싸 37 °C에 둡니다. 15분마다 가볍게 섞어주며 90분 동안 반응시킨 후, 튜브를 원심분리하고 펠릿을 2 mL의 PBS에 재현탁합니다.

원심 분리 후, Hoechst 및 Verapamil 펠릿은 PBS에 희석된 500 µL의 propidium iodide에 재현탁하고, Hoechst 펠릿은 동일한 용액 4 mL에 재현탁합니다. 이제 응집물을 제거하기 위해 샘플을 70 µm 셀 스트레이너로 걸러 FACS 튜브에 옮긴 후, 빛이 차단된 얼음 위에 보관합니다. 다음으로, Hoechst 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 유세포 분석기 소프트웨어의 Global Worksheet 창을 엽니다.

Dot Plot을 클릭하여 Global Worksheet에 그래프를 생성하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터를 선택하십시오. 동일한 방식으로 측방 산란 폭(side scatter wide)과 측방 산란 높이(side scatter height)의 도트 플롯을 생성한 다음, 폴리곤 게이트(polygon gate)를 클릭하여 두 번째 그래프에 P1 영역을 설정함으로써 단일 세포를 선택하고 더블릿(doublets)을 구분하십시오. 다음으로, 적색 Hoechst 영역과 청색 Hoechst 영역의 도트 플롯을 생성하고 세포 위에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 P1 집단을 강조 표시하십시오.

그 다음, 주요 세포군 왼쪽에 사이드 암(side arm) 형태로 나타나는 Hoechst 염색 음성 사이드 팝퓰레이션(side population) 세포를 선택하기 위해 P2 영역을 생성하고, Hoechst 샘플 이벤트 10,000개를 수집합니다. 사이드 팝퓰레이션을 나타내는 P2 게이트가 정확하게 설정되었는지 확인하기 위해, Hoechst 및 Verapamil 샘플 이벤트 또한 10,000개씩 수집합니다. 이때 사이드 팝퓰레이션이 사라져야 합니다.

그런 다음 Hoechst 염료 음성 세포의 side population을 1 mL의 완전 암줄기세포 유사 세포 배지가 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브로 분리하십시오. 분리가 끝나면 세포를 원심 분리하고, side population 펠릿을 1 mL의 신선한 완전 암줄기세포 유사 세포 배지에 재현탁하십시오. 이어서 세포 수를 측정하고 적절한 수의 세포를 새로운 세포 배양 플라스크에 접종하십시오.

분리된 side population 세포에서 CD44-high/ALDH-high 하위 집합을 선택하려면, 먼저 7개의 멸균된 15-milliliter 원추형 튜브에 표시된 대로 라벨을 붙입니다. 다음으로, 분리된 세포를 줄기세포 배지에서 1×10⁷ cells/mL로 희석한 후, 모든 과정을 얼음 위에서 진행하며 unstained CD44-APC 및 IGG1-APC 튜브에는 100 µL의 세포를, ALDH 및 CD44-APC 튜브에는 4 mL의 세포를 각각 분취합니다. 세포를 원심 분리한 후, unstained CD44-APC 및 IGG1-APC 펠릿을 ALDEFLUOR 키트의 100 µL buffer one에 재현탁합니다.

그 다음, ALDH, ALDH 및 DEAB, 그리고 ALDH DEAB 및 CD44-APC 튜브에 ALDH 억제제인 DEAB 5 µL를 각각 첨가합니다. ALDH 및 CD44-APC 튜브의 세포를 buffer one 4 mL와 키트 시약 20 µL가 포함된 시약 C 4 mL에 재부유시키고, 이 세포들 중 100 µL를 즉시 ALDH, ALDH 및 DEAB, 그리고 ALDH DEAB 및 CD44-APC 튜브로 옮깁니다. 이후 모든 튜브를 37 °C 항온 수조에 넣고 빛을 차단한 상태로 30분 동안 배양하며, 15분이 지난 후 부드럽게 볼텍싱하여 샘플을 혼합합니다.

배양 종료 후, 모든 샘플을 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 그다음 모든 튜브를 얼음에 두고, ALDH 및 CD44-APC 펠렛은 4 mL의 buffer A에 재현탁하며, CD44-APC 및 ALDH DEAB 그리고 CD44-APC 펠렛은 동일한 버퍼 100 µL에 재현탁합니다. IGG1-APC 펠렛은 100 µL의 buffer B에, 염색하지 않은 ALDH 및 ALDH와 DEAB 튜브는 100 µL의 buffer one에 재현탁합니다.

10분 후, 모든 샘플을 다시 원심 분리한 다음, ALDH 및 CD44-APC 샘플을 제외한 모든 샘플을 1 mL의 buffer one으로 세척하고, ALDH 및 CD44-APC 샘플은 4 mL의 buffer one으로 세척합니다. 두 번째 원심 분리 후, ALDH 및 CD44-APC 샘플을 제외한 모든 펠릿을 1 mL의 신선한 buffer one에 재부유시키고, ALDH 및 CD44-APC 샘플은 4 mL의 buffer one에 재부유시킵니다. 이제 ALDH 및 CD44-APC 튜브를 유세포 분석기에 로드하고, 이중 염색된 집단을 시각화하기 위해 APC by fitsy dot plot을 생성합니다.

다음으로, ALDH-high 세포를 위한 게이트를 생성하기 위해 ALDH 튜브를 로드합니다. ALDH와 DEAB 튜브를 로드했을 때 양성 세포들이 사라져야 합니다. 동일한 그래프에서 CD44-APC 및 IGG1-APC 튜브를 사용하여 CD44-high 세포를 선택하기 위한 두 번째 게이트를 생성합니다.

IGG1-APC 튜브를 로드하면 양성 세포들이 사라질 것입니다. 그런 다음 ALDH 및 CD44-APC 튜브와 ALDH DEAB 및 CD44-APC 튜브를 로드하여 CD44-high/ALDH-high 세포를 포함하는 세 번째 게이트를 생성하십시오. ALDH-CD44 이중 염색 튜브를 사용하여 이중 양성 세포에 마지막 게이트를 설정하십시오.

그 다음 CD44-high/ALDH-high 세포를 1 mL의 완전 암 줄기세포 유사 세포 배지가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브에 분리하여 수집하고, 필요에 따라 CD44-low/ALDH-low 세포를 1 mL의 완전 세포 배양 배지에 수집합니다. 2차 분리 후, CD44-high/ALDH-high 세포를 완전 암 줄기세포 유사 세포 배지가 포함된 적절한 세포 배양 플라스크에 분주하여 세포 배양 인큐베이터에서 18~24시간 동안 배양합니다. 세포가 플라스크 바닥에 부착되면 배양 배지를 교체하고 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣습니다.

CD44-high/ALDH-high 세포의 종양 형성 능력을 확인하기 위해, 시연된 바와 같이 암줄기세포 유사 단층 배양 세포를 트립신 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻고, 1×10⁶ 개의 세포를 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 원심 분리한 후, recombinant human epidermal growth factor heparin 및 B27이 첨가된 저혈청 배지에서 펠릿을 재현탁하고, 광학 현미경으로 종양 구체(tumor spheres)가 관찰될 때까지 세포 배양 인큐베이터 내의 저부착 페트리 접시에서 세포를 배양합니다. 새로운 세포주에 대해 처음으로 분리 작업을 수행하는 경우, in vitro 무혈청 배지에서 종양 구체를 형성하는 능력을 통해 해당 세포주의 종양 형성 능력을 확인해야 합니다.

또한, QPCR을 통해 CD44-high/ALDH-high 세포에서 beta-catenin 및 기타 줄기세포 유사 마커의 높은 발현이 나타나야 합니다. CD44-high/ALDH-high 세포는 CD44-low/ALDH-low 세포와 비교했을 때 적은 양을 주입해도 체내에서 종양을 형성할 수 있어야 합니다. 숙련된 경우, 각 세포 분류 작업이 적절하게 수행된다면 5시간 이내에 완료될 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때 형광색소로 표지된 시료가 직사광선에 노출되지 않도록 보호하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 전이 과정에서 암 줄기세포의 관여에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 침습 이동 분석(invasion migration assays)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 암 분야의 연구자들이 HNSCC 암에서 종양 탈출 기전을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후, 다변수 유량 세포 분석 및 세포 분류법을 사용하여 HNSCC 세포주에서 암 줄기세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 종양 세포 및 DNA 삽입 제제를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 실험복과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.