Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

O objetivo geral desta análise é quantificar a velocidade do fagossomo em macrófagos infectados pelo HIV-1 usando um método simples de rastreamento manual. A vantagem deste protocolo é fornecer um método fácil para calcular os movimentos relativos de grupos de objetos dentro de uma célula que podem estar em movimento ou deformados. Este método fornece informações sobre o movimento de fagossomos em macrófagos infectados com GFP-positivo, mas pode ser usado para outros compartimentos intercelulares em células marcadas com fluorescência.

Depois de infectar macrófagos derivados de monócitos humanos e opsonizar células sanguíneas criadas em ovelhas, de acordo com o protocolo de texto, montar um ensaio de fagocitose usando um sistema de imagem confocal, como um microscópio de disco giratório, equipado com uma câmara de aquecimento a 37 graus Celsius, com dióxido de carbono. Antes do experimento, ligue a câmara de aquecimento para aquecer o microscópio stage a 37 graus Celsius. Em seguida, ligue o microscópio e o computador e carregue o software de imagem.

Otimize as configurações de imagem, como velocidade de digitalização, ampliação, resolução, etc., para ter pelo menos uma célula por campo e para criar imagens de um quadro a cada minuto entre 60 a 120 minutos. Coloque a placa de imagem na platina do microscópio. Ajuste o foco e a localização para encontrar apenas um macrófago infectado pelo HIV-1 inteiro no campo.

Use as configurações apropriadas de excitação e emissão com base no sistema de imagem e na sonda usados. Inclua um canal de campo claro. Otimize sua aparência ajustando o tempo de exposição.

Em seguida, remova a placa de imagem e adicione um mililitro de célula sanguínea de ovelha, ou suspensão SRBC, a sete vezes o décimo dos sextos SRBCs por mililitro, à placa. Centrifugue o prato a 500 vezes g por dois minutos à temperatura ambiente para sincronizar a fagocitose, registre o tempo no final da centrifugação e retorne o prato ao estágio. Otimize o foco e defina a parte superior e inferior da pilha com uma distância de passo de 0,3 micrômetros.

Inicie a aquisição das pilhas Z de imagens GFP e BF em toda a espessura da célula e salve o vídeo de lapso de tempo no formato de arquivo nativo do sistema de imagem. Para realizar a edição de vídeo, no software de edição de vídeo, clique no menu suspenso Aplicativos e na guia Revisar dados multidimensionais. Para abrir o arquivo, clique em Selecionar arquivo base e, em seguida, em Selecionar diretório.

Na caixa Conjuntos de Dados, selecione a aquisição a ser analisada e clique em Exibir. Para representar a infecção em uma projeção Z, na caixa Comprimentos de onda, selecione o comprimento de onda de 491 nanômetros e clique na guia Projeção Z com todos os planos. Em seguida, para analisar uma sequência de tempo, na caixa Comprimentos de onda, selecione o comprimento de onda BF e escolha o plano ideal no eixo Z para distinguir SRBCs externos, SRBCs internos e o núcleo.

Salve as montagens de vídeo clicando na guia Seleção Xs e depois em Carregar imagens. Por fim, salve as imagens carregadas no formato tif. Depois de baixar o plug-in de rastreamento manual Image J, abra o plug-in na Imagem J e, em seguida, abra a sequência de imagens a ser analisada.

Insira as configurações, como intervalo de tempo, que representa a quantidade de tempo entre quadros adjacentes, e a calibração XY, que representa a distância por pixel. Para iniciar o rastreamento, clique em Adicionar faixa e clique em um centro SRBC na primeira vez que ele for internalizado. O próximo quadro aparece automaticamente.

Por conveniência, para ver SRBCs no canal BF, use a janela de brilho e contraste durante o rastreamento. Continue a clicar no centro SRBC em todos os quadros para ter posições diferentes durante o tempo. Entre cada rastreamento SRBC, clique em Finalizar faixa e, em seguida, em Adicionar faixa para iniciar uma nova faixa.

O número de rastreamento será alterado na segunda coluna da tabela de resultados. Comece a rastrear o núcleo para ter sua posição em todos os quadros clicando em seu centro conforme realizado anteriormente. Salve os dados em uma planilha, abra-a no software de planilha e crie um novo arquivo de planilha.

Transfira para este novo arquivo a hora e as coordenadas X e Y do SRBC e do núcleo. Finalmente, use o software de planilha para calcular a distância percorrida de fagossomos contendo SRBCs em direção ao núcleo e a velocidade dos fagossomos durante os primeiros cinco minutos após a internalização de SRBCs de acordo com o protocolo de texto. A análise do movimento do fagossomo em macrófagos vivos infectados pelo HIV em tempo real usando microscopia confocal de disco giratório é mostrada aqui.

As configurações para o canal de campo claro são críticas para ver o núcleo e para discriminar os SRBCs externos dos internalizados. Este gráfico traça a distância percorrida por um fagossomo em HMDMs não infectados nos primeiros cinco minutos após a internalização de um SRBC versus tempo. A velocidade do fagossomo é a inclinação da curva de regressão linear mostrada aqui.

Por fim, neste estudo, observou-se que a velocidade do fagossomo durante os primeiros cinco minutos após a internalização em HMDMs infectados pelo HIV é menor em comparação com HMDMs não infectados. Esses métodos demonstraram que o movimento do fagossomo para o centro da célula e, portanto, a maturação do fagossomo em fagolisossomos, foi prejudicado em macrófagos infectados pelo HIV. Após sua aquisição, uma célula pode ser processada posteriormente para microscopia eletrônica correlativa ou a população de células inteiras pode ser fixada para microscopia de imunofluorescência clássica e análise estatística.

A fagocitose é muito sensível à temperatura e, portanto, a temperatura dentro da câmara de aquecimento e do meio da placa de cultura deve ser mantida a uma constante de 37 graus Celsius durante todo o procedimento. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos pode ser perigoso e precauções como trabalhar em uma sala de biossegurança e usar equipamentos de proteção individual devem ser tomadas de acordo com a legislação local.