Perturbations de circulation miARN dans le syndrome du côlon irritable détectée en utilisant un multiplexée à haut débit Gene Expression Plate-forme

L’objectif global de ce protocole de quantification multiplex des acides nucléiques est de quantifier numériquement l’expression des microARN dans le sang total. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude des troubles digestifs. Il aide à l’identification des mécanismes moléculaires dérégulés et des signatures de biomarqueurs, comme les microARN.

Le principal avantage de cette technique est que la quantification des microARN ne repose pas sur l’amplification. Cette technologie compte numériquement les cibles moléculaires et est largement automatisée. Pour purifier l’ARN total, décongelez et incubez des échantillons de sang total précédemment prélevés et congelés pendant deux heures.

À l’aide d’un rotor à godets oscillants, centrifuger les tubes à 5 000 fois g à température ambiante pendant dix minutes. Ensuite, retirez les surnageants en le versant ou en le pipetant soigneusement dans un tube à déchets, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ajoutez quatre millilitres d’eau sans RNase à la pastille.

Replacez solidement le capuchon et agitez jusqu’à ce que la pastille soit visiblement dissoute. Ensuite, centrifugez à nouveau le tube et retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez 350 microlitres de tampon BM1 au granulé et vortex jusqu’à ce que le granulé soit visiblement dissous.

Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube de traitement de deux millilitres pour l’extraction automatisée de l’ARN total. À l’aide d’un kit d’extraction d’ARN disponible dans le commerce, effectuez une purification automatisée de l’ARN intracellulaire, y compris les microARN de l’échantillon de sang entier, en chargeant des pointes de pipette préchargées, des tubes à centrifuger, des tampons et des réactifs fournis dans le kit de purification d’ARN dans le système d’extraction d’ARN robotisé. Dans le menu de sélection des protocoles, choisissez le protocole Blood miRNA PartA et démarrez l’exécution.

Terminez l’extraction de l’ARN et stockez les échantillons conformément au protocole de texte. Préparez des échantillons de microARN en utilisant d’abord de l’eau exempte de RNase pour normaliser 12 échantillons d’ARN à 33 nanogrammes par microlitre. Avec de l’eau sans nucléases, préparez une dilution de 1 sur 500 des contrôles de microARN fournis dans le kit de dosage, et gardez sur de la glace.

Ensuite, préparez le mélange maître de recuit en combinant 13 microlitres de tampon de recuit, 26 microlitres de réactif de micro R-tag et 6,5 microlitres de contrôles de microARN. À chacun des 12 tubes de bande de 0,2 millilitre, ajoutez 3,5 microlitres du mélange maître de recuit, puis ajoutez 3 microlitres de l’échantillon d’ARN. Retournez les tubes pour les mélanger, faites-les tourner à 2000 fois g avec une mini-microcentrifugeuse de paillasse et faites passer les tubes dans un thermocycleur à l’aide du programme suivant.

Ensuite, préparez un master mix de ligature en combinant trois microlitres de tampon de ligature et 19,5 microlitres de PEG. Ensuite, ajoutez 2,5 microlitres du mélange maître de ligature à chacune des réactions. Après avoir mélangé et essoré les tubes, remettez-les dans le thermocycleur à 48 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ajoutez ensuite un microlitre de ligase directement à chaque échantillon pendant qu’il est encore dans le bloc du thermocycleur, et incubez les tubes à l’aide du programme suivant. Mélangez et tournez doucement les tubes, et ajoutez un microlitre d’enzyme de nettoyage de la ligature à chaque échantillon. Ensuite, incubez les tubes dans le thermocycleur comme indiqué ici.

Après l’incubation, ajoutez 40 microlitres d’eau sans RNase aux échantillons avant de les mélanger et de les faire tourner. Pour effectuer l’hybridation des microARN, décongelez les ensembles de sondes rapporteures et de capture fournies sur de la glace, puis faites-les tourner. Ajoutez 130 microlitres de tampon d’hybridation au Reporter Code Set 2 et mélangez pour créer le mélange maître d’hybridation.

Dans 12 nouveaux tubes de bande de 0,2 millilitre, ajoutez 20 microlitres du master mix d’hybridation. Dénaturez les échantillons de microARN qui viennent d’être préparés à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes et refroidissez-les sur de la glace. Ensuite, ajoutez 5 microlitres d’échantillons de microARN dans chacun des tubes de bandelettes contenant le mélange maître d’hybridation.

Programmez le thermocycleur à 65 degrés Celsius, à une température calculée en fonction du volume de 30 microlitres, et le couvercle chauffant au réglage Forever time afin qu’il ne descende pas à 4 degrés Celsius à la fin du cycle. Ajoutez 5 microlitres de la sonde de capture réglée dans chaque tube et mélangez. Ensuite, après les avoir fait tourner, placez immédiatement les tubes dans le thermocycleur à 65 degrés Celsius.

Incuber les échantillons pendant au moins 12 heures et pas plus de 30 heures. Installez la station de préparation en chauffant d’abord la cartouche et les plaques à température ambiante. Faites ensuite tourner les plaques.

Pour charger la station de préparation, ouvrez la porte de la station et chargez les plaques de réactifs, la cartouche, les pointes de pipette, les échantillons préparés dans des tubes à bande de 0,2 millilitre et deux tubes vides de 12 tubes de 0,2 millilitre aux endroits appropriés dans le robot. Retirez les capuchons du tube de la bande et le couvercle de la plaque de réactif. Ensuite, fermez la porte de la station de préparation et exécutez le test approprié à partir du panneau de commande.

Pour visualiser et compter les codes-barres des complexes tripartites immobilisés et orientés, retirez la cartouche de la station de préparation, utilisez le couvercle fourni pour la sceller et placez-la dans l’analyseur numérique dans n’importe quel emplacement disponible. Utilisez l’écran tactile pour créer un fichier de définition de cartouche, ou CDF. Assurez-vous que le fichier de bibliothèque de rapporteurs approprié est attribué à chaque échantillon dans la CDF.

Une fois la numérisation terminée, téléchargez les fichiers de données de l’analyseur numérique à l’aide d’une clé USB ou par e-mail, avant de traiter et d’analyser les données, conformément au protocole de contrôle qualité et d’analyse associé. Le système de test de la plate-forme d’expression génique réduit le bruit technique grâce à sa nature hautement automatisée, et la chimie unique qu’il utilise produit des données d’expression génique de haute précision. Les réplicats techniques présentés ici démontrent la haute reproductibilité de la quantification de l’expression des microARN endogènes et viraux qui est possible.

À l’aide de cette méthode, les microARN humains endogènes et codés par le virus qui présentent une déviation de l’expression attendue, telle que définie par les participants sains à l’étude, peuvent être identifiés comme des cibles d’intérêt dans le SCI. La précision et la sensibilité de la méthode permettent de détecter des perturbations parmi des cibles à faible expression, et des perturbations subtiles peuvent également être observées de manière fiable. Ces figures montrent certaines des perturbations des microARN circulants dans le SCI et les sous-types du SCI, par rapport aux témoins sains.

Les deux microARN différentiellement élevés les plus significatifs chez les participants au SCI sont présentés ici. Les courbes de ce graphique de violon indiquent la fréquence des comptages pour miR-150. Les barres verticales représentent les premier et troisième quartiles, et le carré rouge indique le dénombrement médian.

À la suite de cette procédure, des tests personnalisés plus ciblés basés sur la même technologie peuvent être effectués afin de valider les signatures de biomarqueurs dans des cohortes plus importantes et d’explorer les associations essentielles d’ARN et de protéines. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche biomédicale pour développer rapidement, avec précision et exactitude, des panels de biomarqueurs diagnostiques pour la maladie.