Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do In Vitro Efeito profilático de interferões

O objetivo geral deste estudo é estabelecer um sistema de cultura infecciosa in vitro do vírus Zika baseado em células de mamíferos para estudar a replicação do vírus Zika, bem como a utilização da plataforma in vitro para o desenvolvimento de medicamentos. Este protocolo detalhado passo a passo do sistema de cultura de células infecciosas do vírus Zika pode ajudar a abordar o mecanismo da patogênese da doença mediada pelo vírus Zika e a evolução da virulência viral. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode permitir a produção em larga escala do vírus Zika para o desenvolvimento de medicamentos e vacinas.

Comece colhendo células Vero com 80% de densidade celular em um frasco de cultura T75, aspirando o meio do frasco e enxaguando as células com dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Adicione dois mililitros de 0,25% de tripsina e incube o frasco a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, adicione oito mililitros de meio de crescimento contendo soro para inativar a tripsina.

Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, remova 10 microlitros de células e misture com uma quantidade igual de 0,4% de azul de tripano. Carregue a mistura preparada na lâmina da câmara de contagem de células e obtenha a conta das células viáveis usando um contador de células automatizado.

Semeie um total de sete milhões de células em um frasco T160 em um volume de 30 mililitros. No dia seguinte, preparar uma multiplicidade apropriada de infecção do inóculo do vírus Zika em 10 mililitros de meio de cultura isento de soro por frasco. O manuseio seguro do vírus é fundamental para evitar a propagação da infecção.

Remova o meio gasto do frasco T160 e adicione os 10 mililitros completos de inóculo viral recém-preparado. Incubar os frascos inoculados a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por quatro a seis horas. Espalhar o inóculo inclinando suavemente o balão para o lado a cada hora de incubação.

Ao final da incubação, substitua o inóculo por 30 mililitros de meio de crescimento suplementado com soro quente. Em seguida, continue a cultura viral pelas próximas 96 horas. Após quatro dias, verificar a progressão da infecção observando o aparecimento de placas virais na monocamada celular, usando um microscópio de contraste de fase.

Tire fotos conforme necessário com ampliação de 40x e 200x. Colha sobrenadantes de cultura de células no ponto de 96 horas e centrifugue o sobrenadante a 300 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos celulares. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os sobrenadantes sem perturbar os detritos peletizados e transfira-os para tubos de 15 mililitros.

Armazene os sobrenadantes da cultura viral em alíquotas múltiplas a 80 graus Celsius negativos. Para titular o vírus, primeiro semeie células Vero virgens em uma placa de 12 poços de uma vez 10 para a quinta células por poço, em um volume de dois mililitros. No dia seguinte, preparar diluições seriadas dez vezes dos sobrenadantes das culturas virais, colhidas do balão T160 utilizando meio isento de soro.

Ao preparar diluições em série, um sobrenadante de cultura viral para ácidos titulados, certifique-se de manusear o vírus com segurança para evitar infecções. Em seguida, remova o meio gasto de cada poço da placa de 12 poços contendo células Vero e adicione 400 microlitros do inóculo diluído às células Vero em triplicata. Incubar as placas inoculadas na incubadora de cultura de tecidos durante quatro a seis horas.

No final da incubação, substitua o inóculo por dois mililitros de meio suplementado com soro por alvéolo. Às 48 horas após a inoculação, contar os focos virais nas diluições apropriadas, usando um microscópio de contraste de fase. Calcule o título viral como unidades formadoras de placa por mililitro.

Após a inoculação de células Vero em uma placa de 12 poços com títulos altos e baixos de zika vírus e incubação por 48 e 96 horas, a replicação do genoma é avaliada por PCR quantitativo para expressão do genoma do vírus zika e por imunocitoquímica para RNA de fita dupla. Para imunocitoquímica, remova o meio dos poços da placa de 12 poços e adicione um mililitro de metanol a cada poço. Deixe as células se fixarem a quatro graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, lave as células fixas três vezes com 1x PBS. Em seguida, adicione o tampão de bloqueio e incube por uma hora em temperatura ambiente. Diluir o anticorpo monoclonal de RNA de fita dupla de camundongo J2 de um a 100 no tampão de bloqueio.

Adicione-o às células e incube as células nesta solução durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, dilua o anticorpo secundário IgG-594 anti-camundongo de cabra um a 1.000 em tampão de bloqueio e, após lavar as células com 1x PBS, adicione-o às células e incube-as por uma hora em temperatura ambiente. Depois de lavar as células com 1x PBS, corar os núcleos usando corante hoechst e observar as células usando um microscópio fluorescente com ampliação de 100x.

Seis horas após a semeadura de uma placa de 12 poços com células Vero virgens, como antes, adicione citocinas de interesse nas concentrações indicadas em duplicatas biológicas. 12 horas após o tratamento, realize a infecção pelo vírus Zika e inclua poços de controle negativo sem infecção. Quatro horas após a infecção, substitua o inóculo viral por meio tratado com citocina e incube as células a 37 graus Celsius por mais 44 horas.

Às 48 horas após a infecção, conte as placas virais usando um microscópio de contraste de fase e adquira imagens representativas das células infectadas com aumento de 40x. Este gráfico mostra o conteúdo genômico do vírus Zika medido por RT-qPCR, tanto o genótipo Pan quanto os primers da cepa PRVABC-59 mostraram igual sensibilidade e especificidade. Como esperado, os primers virais da hepatite C não amplificaram nenhum produto.

cinética de crescimento viral do zika nos pontos de tempo indicados em células infectadas de baixo e alto título, em comparação com a do controle simulado não infectado, é mostrada aqui. Os resultados do ensaio de imunocitoquímica mostram que, 48 horas após a infecção, as células infectadas estão em alguns grupos, enquanto 96 horas após a infecção, a maioria das células está infectada. Este gráfico mostra a modulação do crescimento viral do Zika por várias citocinas, em comparação com a do veículo controle.

Essas imagens de contraste de fase mostram células infectadas pelo vírus Zika com ou sem tratamento com citocinas. Placas virais formadas por células infectadas podem ser vistas como focos. Observe que os poços tratados com interferon não possuem placas virais.

Após esse procedimento, outros métodos, como o mapeamento de domínio de alta resolução do vírus Zika para localização e replicação de proteínas virais em células de mosquitos e humanas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como elucidação do mecanismo de patogênese da doença e evolução da virulência viral. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer o sistema de cultura infecciosa do vírus Zika in vitro baseado em células de mamíferos para estudar a replicação do vírus Zika, bem como o apaziguamento da plataforma in vitro para o desenvolvimento de medicamentos e vacinas.