Coleção de sérica e sem Alimentador rato-tronco embrionárias Médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular

Os objetivos gerais deste protocolo são coletar meio condicionado de células-tronco embrionárias de camundongos sob condições de soro e cultura livre de alimentador e caracterizar as funções biológicas desse meio. Este procedimento fornece informações sobre a atividade anti-senescência de fatores solúveis secretados por células-tronco embrionárias de camundongos para o desenvolvimento de uma abordagem terapêutica segura e livre de células para doenças relacionadas à idade. Demonstrando este procedimento estará o Dr. Yun-Ui Bae, professor pesquisador do meu laboratório.

Em uma capa de segurança biológica, trate um fibroblasto embrionário de camundongo ou cultura de células MEF com 20 mililitros de meio MEF suplementado com mitomicina C em uma placa de cultura de células de 15 centímetros por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No final da incubação, lave as células três vezes com PBS e separe-as com três mililitros de tripsina EDTA por três minutos a 37 graus Celsius. Neutralizar a tripsina com seis mililitros de meio MEF fresco quando as células forem levantadas do fundo da placa.

Depois de coletar as células por centrifugação, ressuspender o pellet em cinco mililitros de meio MEF e colocar duas vezes 10 elevado ao sexto MEF inativado por placa de cultura de 10 centímetros em meio MEF fresco. Cultive as células alimentadoras por 24 horas. Em seguida, substitua o meio MEF por meio de células-tronco embrionárias de camundongo e semeie duas vezes 10 até o sexto embrião de camundongo

Em uma capa de segurança biológica, lave uma placa de células-tronco embrionárias de camundongo com cinco mililitros de PBS e retire as células com tripsina mais EDTA, conforme demonstrado. Depois de coletar as células por centrifugação, ressuspenda o pellet de células-tronco em cinco mililitros de meio de células-tronco frescas e coloque um mililitro de células por placa em meio de células-tronco embrionárias frescas em cinco placas de cultura de células revestidas de gelatina. Retorne as células para a incubadora até que as culturas atinjam 80-85% de confluência.

Em seguida, enxágue as células em pelo menos oito mililitros de PBS por placa por três lavagens de 10 minutos, seguidas de uma incubação de 24 horas em meio de soro reduzido. Após não mais de 24 horas, transferir o sobrenadante para um tubo cónico de 50 ml para centrifugação. Seguido de filtração através de um filtro superior de garrafa de 0,2 micrômetro.

Para testar os efeitos do meio condicionado de células-tronco embrionárias por um ensaio de beta galactosidase associado à senescência, semeie fibroblastos dérmicos humanos em uma placa de seis poços em um meio de fibroblastos dérmicos humanos. Após uma incubação noturna a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, substitua metade do meio por meio fresco condicionado com células-tronco embrionárias de camundongo por mais 72 horas de cultura. No terceiro dia de cultura, enxágue as células em dois mililitros de PBS por poço por duas lavagens de 30 segundos.

Em seguida, fixe as células em 3,7% de paraformaldeído por cinco minutos em temperatura ambiente em uma capela de exaustão. Após a fixação, lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS, como acabamos de demonstrar, e rotule as células com um a dois mililitros de solução SA beta gal por 17 horas e meia a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono. No final do período de coloração, lave as células duas vezes com PBS, conforme demonstrado.

Em seguida, contra-core com Eosen por cinco minutos em temperatura ambiente. Após outro conjunto de lavagens de PBS, obtenha imagens das células com uma ampliação de 100 vezes por microscopia de luz. Para análise do ciclo celular, semeie oito vezes 10 elevado ao quarto fibroblasto dérmico humano por poço em uma placa de cultura de células de seis centímetros em meio de fibroblasto dérmico humano fresco para uma incubação noturna a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Na manhã seguinte, substitua metade do meio por meio condicionado por células-tronco embrionárias de camundongo e devolva as células à incubadora. Após 24 horas, colher as células por dissociação de tripsina EDTA seguida de duas lavagens em um mililitro de solução de PBS. Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de solução fria de PBS após a segunda lavagem.

Em seguida, fixe as células com a aplicação gota a gota a 200 microlitros de etanol frio durante o vórtice. Armazene as células a quatro graus Celsius por pelo menos uma hora. Em seguida, lave-os em solução fresca de PBS.

Após a segunda centrifugação, trate o pellet com 250 microlitros de tampão citrato de sódio suplementado com RNase por 30 minutos a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono. No final da incubação, rotule as células com 250 microlitros de tampão citrato de sódio contendo iodeto de propídio por 20 minutos. Em seguida, avalie os estágios do ciclo celular de cada amostra por citometria de fluxo.

Para análise quantitativa de PCR via transcriptase reversa, use um kit de extração de RNA para isolar o RNA total de fibroblastos dérmicos humanos tratados com meio de células-tronco embrionárias de camundongo de acordo com o protocolo do fabricante. Use um espectrofotômetro para quantificar o RNA total extraído. Em seguida, formule a mistura de reação contendo os primers oligodesoxitimidina e a transcriptase reversa M-MLV de acordo com o protocolo do fabricante.

Em seguida, adicione um micrograma do RNA total ao tubo de PCR que contém a mistura de reação. Finalmente, meça a amplificação do CDNA com uma máquina de PCR em tempo real usando a mistura principal de PCR verde e os primers gênicos apropriados. As células-tronco embrionárias de camundongo cultivadas em condições normais de cultura de células-tronco embrionárias de camundongo em uma camada de células alimentadoras de MEF exibem uma forma oval e uma aparência brilhante.

Enquanto as células-tronco embrionárias de camundongos cultivadas em condições de cultura livre de soro e alimentador demonstram uma morfologia achatada e irregular. O tratamento do fibroblasto dérmico humano senescente com meio condicionado por células-tronco embrionárias de camundongo diminui o número de células positivas senescentes associadas à betagalactosidase. Além disso, a análise do ciclo celular dessas células revela que o tratamento com meio condicionado com células-tronco embrionárias de camundongo aumenta drasticamente o número de células nas fases S e G2 / M, reduzindo o número de células na fase G0 / G1.

Além disso, o tratamento com meio condicionado com células-tronco embrionárias de camundongo diminui a expressão de genes associados à senescência e de citocinas secretárias associadas ao fenótipo senescente. Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar de coletar o soro e o meio livre de alimentador após 24 horas, pois uma longa incubação aumenta a possibilidade de autólise celular ou apoptose por inanição. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar soro e meio condicionado de células-tronco embrionárias de camundongo sem alimentador para uma abordagem livre de células.

Não se esqueça de que trabalhar com reagentes como o paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e que as precauções, como manusear esse reagente em uma capela de exaustão, devem sempre ser tomadas ao realizar esse procedimento.