Induction et diagnostic des tumeurs dans Drosophila Imaginal Disc Epithelia

L’objectif global de cette procédure est de générer des clones de mosaïque tumérogénique dans les disques imaginaux de la drosophile en développement, puis de classer les lésions clonales en différents stades de développement tumoral. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé de la modélisation du cancer. Par exemple, comment induire systématiquement des tumeurs et comment classer le stade de progression.

Les principaux avantages de cette technique sont que l’injection tumorale dans les disques imaginaux de l’aile de la drosophile est réalisée à l’aide de la génétique de la mouche simple, et que la classification des stades de développement de la tumeur est un diagnostic simple. Aux côtés de Kenta Morimoto, Kimiko Morimoto, une technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par mettre en place le croisement génétique.

12 heures avant de prélever des vierges pour le croisement, éliminez toutes les mouches adultes des flacons contenant des pupes matures. Le lendemain, mettez en place un croisement pour générer une descendance génétiquement mosaïque. Transférez 12 à 20 vierges et 10 mâles dans un flacon frais et incuberez-les pendant une journée à 25 degrés Celsius.

Après 24 heures, transférez les mouches dans un flacon frais et jetez le premier flacon qu’elles ont rempli. Après 12 heures supplémentaires, les œufs commenceront à être disponibles. À intervalles de 12 heures, transférez les adultes dans de nouveaux flacons et utilisez la progéniture pour l’expérience.

Après avoir incubé des flacons d’œufs pendant deux à quatre jours à 25 degrés Celsius, électrocutez les larves pendant dix à 45 minutes, à l’aide d’un bain-marie à 37 degrés Celsius, pour l’induction de clones en mosaïque par GAL4. Un choc thermique à deux jours de développement générera des clones dans des disques immatures. Après trois ou quatre jours de développement, les chocs thermiques généreront des clones dans des disques plus avancés.

Après le choc thermique, remettez les flacons dans l’incubateur à 25 degrés Celsius, jusqu’à ce que les larves du troisième stade soient disponibles. Pour commencer, utilisez un bâton en bois ou une pince émoussée pour transférer les larves errantes du troisième stade dans une boîte de Pétri avec PBS. Ensuite, génotypagez-les sous une lumière fluorescente afin d’identifier les marqueurs fluorescents appropriés pour les larves de mosaïque.

Avant de continuer, lavez les larves avec du PBS. Ensuite, sous un microscope de dissection, utilisez deux paires de pinces pour pincer le centre de la larve et déchirer le corps en deux. Ensuite, pincez les crochets buccaux, tout en poussant la bouche vers le corps, pour retourner le corps à l’envers.

Ensuite, retirez les matériaux inutiles, tels que les glandes salivaires et les corps adipeux. Les larves sont maintenant préparées pour la fixation et la coloration des anticorps, ce qui est détaillé dans le protocole textuel. Transférez les préparations de tissus colorés sur une lame de microscope à l’aide d’une pipette de transfert en plastique de deux millilitres.

Ensuite, à l’aide d’une pince, déplacez les larves individuelles dans des gouttes de support de montage sur une lame de microscope. Maintenant, à l’aide d’une pince, isolez les disques imaginaux. Commencez par maintenir l’extrémité du tissu disséqué et retirez le cerveau et les disques antennaires oculaires avec l’autre pince.

Gardez le cerveau prêt à l’emploi. Localisez maintenant les disques imaginaux de l’aile. Les disques imaginaux de l’aile sont collés sur la face latérale du tissu disséqué.

Ensuite, fixez le tissu avec une pince et grattez doucement les disques de l’aile. Ensuite, placez les cerveaux près des disques alaires, pour les protéger de l’écrasement par la lamelle. Maintenant, couvrez doucement les structures avec une lamelle et scellez la lamelle avec du vernis à ongles.

Rangez la diapositive à quatre degrés Celsius. Après avoir utilisé un microscope confocal pour acquérir les images confocales de la pile Z, ouvrez-les dans ImageJ et utilisez la commande Reslice pour créer des coupes virtuelles. Ils peuvent être réalisés sur l’axe X-Z, l’axe Y-Z ou dans un plan personnalisé.

Pour créer le plan personnalisé, tracez une ligne droite, ou rectangle, sur l’image de la pile Z, puis suivez les instructions pour que l’ordinateur génère sa section. Utilisez de telles sections pour diagnostiquer le tissu pour les phénotypes tumoraux. Tout d’abord, identifiez les masses cellulaires qui s’écartent de la couche épithéliale principale ou qui montrent une excroissance.

Ensuite, pour chaque masse, déterminez si la localisation subcellulaire des protéines jonctionnelles semble normale. D’autres considérations incluent la taille de la masse et toute indication d’une prolifération cellulaire accrue dans la masse. Ainsi, le type de tumeur est identifié.

Dans cet exemple, quatre clones ont été classifiés, à l’aide de coupes verticales générées par le logiciel d’imagerie. Deux ont été classés comme dysplasie, parce que la protéine DLG marquée était mal localisée. Le clone B mesure moins de quatre cellules et le clone C ne s’écarte pas de l’épithélium.

Par conséquent, ni B ni C n’ont été classés comme néoplasmes. Les deux autres clones ont également montré une mauvaise localisation de DLG et ont formé des masses cellulaires tumorales à l’extérieur de l’épithélium. Comme la taille de ces clones tumoraux déplacés était de plus de quatre cellules de diamètre, ces clones ont été classés comme néoplasiques.

En utilisant les méthodes décrites, le gène LGL a été désactivé dans la poche de l’aile et les régions charnières, à l’aide de l’ARNi piloté par sd-GAL4. Chez les témoins dépourvus du transgène ARNi, il n’y avait aucune altération morphologique dans les disques alaires du troisième stade. Dans les knock-downs, des déformations épithéliales et des proliférations tumorogènes ont été clairement observées dans certaines parties de la charnière.

Cependant, aucune prolifération dysplasique n’a été observée dans la région de la poche alaire. Cela était inversement corrélé avec l’expression de MMP1 dans ces régions : une protéine qui fournit une capacité métastatique. Pour surveiller la progression de la croissance tumorale induite par l’inactivation des LGL, des clones sporadiques, exprimant LGL-RNAi, ont été générés dans les disques alaires, comme décrit.

Deux jours après le choc thermique subi par les larves du deuxième stade, certains clones renversés dans la région de la charnière ont montré une déviation de la face apicale de la couche épithéliale. Quatre jours après l’induction du choc thermique, des lésions dysplasiques dans la région de la charnière sont devenues claires, suggérant que les clones knock-down de LGL, déplacés du côté apical, prolifèrent dans la lumière. Sept jours après l’induction du choc thermique, les proliférations tumorogènes dominaient les régions charnières.

Lors de l’utilisation de systèmes GAL4 rabattables, il est important de se rappeler d’examiner l’effet de la modification du moment du choc thermique sur les phénotypes clonaux, car le potentiel tumorogène des cellules du disque imaginal peut dépendre des événements de signalisation endogène du stade de développement ou de la différenciation cellulaire.