ShARN regroupée écran pour la réactivation de MeCP2 sur le Chromosome X inactif

Commencez cette procédure par la préparation des fibroblastes du tendon de souris, comme décrit dans le protocole textuel. Récoltez les cellules d’une plaque de 10 centimètres en aspirant d’abord le milieu. Ajoutez ensuite un millilitre de 0,05 % de trypsine EDTA et incubez pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, trempez la trypsine avec neuf millilitres de DMEM-10 et recueillez les cellules remises en suspension dans un tube conique de 15 millilitres. Diluez les cellules avec du DMEM-10 jusqu’à une concentration finale d’une cellule par 100 microlitres. Transférez ensuite les cellules sur des plaques à 96 puits en pipetant 100 microlitres de suspension dans chaque puits.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les puits soient confluents, ce qui peut prendre jusqu’à deux à trois semaines. Remplacez le support par du DMEM-10 frais tous les trois à cinq jours. Lorsqu’elles sont confluentes, mobilisez les cellules avec 20 microlitres de 0,05 % de trypsine EDTA par puits et divisez-les en deux ensembles dupliqués de plaques de 96 puits.

Dosage de l’activité de la luciférase dans un ensemble de plaques. Utilisez un test de luciférase Firefly homogène qui ne nécessite pas de retrait de support, en suivant le protocole inclus avec le kit de dosage de la luciférase. Utilisez les résultats du test pour sélectionner des clones sans activité luciférase détectable dans l’ensemble restant de plaques.

Étendez d’abord ces clones à une plaque de 24 puits, puis à une plaque à six puits. Effectuez la même chose pour un clone avec l’activité de luciférase la plus élevée. Il sera utilisé comme contrôle positif à des fins de validation.

Après l’expansion dans la plaque à six puits, prélever une aliquote de chaque puits pour un transfert Western. Mobilisez les cellules avec 200 microlitres de 0,05 % de trypsine EDTA. Incuber les cellules pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Trempez les cellules avec deux millilitres de DMEM-10 et transférez la moitié des cellules sur une autre plaque à six puits. Attendez que les cellules se fixent au bas de la plaque. Ensuite, lavez les cellules une fois avec du PBS avant la lyse pour le Western blot.

Plaquez plusieurs clones négatifs à 0,2 million de cellules par puits dans une plaque à six puits. Traitez les cellules une fois avec 10 micromolaires de 5-azacytidine. Ensuite, incubez pendant 72 heures sans changer de milieu avant de doser l’activité de la luciférase, comme précédemment.

Ensuite, choisissez un clone négatif qui a acquis une activité de luciférase avec la 5-azacytidine pour l’écran, et commencez à l’étendre à plusieurs plaques de 10 centimètres. Congelez les clones négatifs restants dans de l’azote liquide en guise de sauvegarde. Le clone positif peut être conservé dans la culture tissulaire ou congelé jusqu’à une utilisation ultérieure.

Le matin, placez un million de cellules X inactives sur des plaques de culture tissulaire de 10 centimètres. Dans l’après-midi, infectez les plaques en remplaçant le milieu par du DMEM-10 frais contenant une quantité prédéterminée de surnageant viral et cinq à 10 microgrammes par millilitre de polybrène. Après 18 à 24 heures, aspirez le média et ajoutez 10 millilitres de DMEM-10 frais dans chaque assiette.

Laisser reposer les plaques pendant 48 heures supplémentaires. Le matin, mobilisez les cellules à l’aide d’un millilitre de 0,05 % de trypsine EDTA par plaque, et trempez les cellules avec 9 millilitres de DMEM-10 par plaque. Faites passer la suspension à travers un filtre à mailles de 100 microns.

Rassemblez les suspensions filtrées et ensemencez deux ensembles de plaques de 10 centimètres à raison d’un million de cellules par plaque. Dans l’après-midi, remplacez le support d’un ensemble de plaques par du DMEM-10 contenant 15 microgrammes par millilitre d’hygromycine B.In l’autre ensemble, remplacez le support par du DMEM-10 frais uniquement. Après 48 heures, mobiliser les cellules des plaques non traitées à l’hygromycine B à l’aide d’un millilitre de 0,05 % de trypsine EDTA.

Incuber pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, trempez les cellules avec 9 millilitres de DMEM-10. Prélevez les échantillons individuels et procédez immédiatement à l’extraction de l’ADN.

Poursuivez la culture de l’ensemble de sélection d’hygromycine B pendant six jours supplémentaires, en réapprovisionnant le milieu de sélection avec du DMEM-10 frais contenant de l’hygromycine B tous les deux jours. Le sixième jour, remplacez le support de sélection par du DMEM-10 frais uniquement. Attendez quatre jours pour la récupération, puis récoltez l’ADN de l’échantillon post-sélection comme précédemment.

Procéder à l’identification des épingles à cheveux enrichies dans les échantillons de post-sélection, comme décrit dans le protocole textuel. Pour valider les résultats, ensemencez d’abord huit millions de cellules de 293 pieds par plaque sur des plaques de 10 centimètres. Le lendemain, remplacez le milieu par neuf millilitres de DMEM-10 sans antibiotique par plaque 30 minutes avant la transition.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de mélange de transfection un à chaque aliquote de mélange de transfection deux, et mélangez doucement par pipetage. Incuber ensuite le mélange à température ambiante pendant 20 minutes. Appliquez le mélange sur chaque assiette en goutte à goutte et faites tourner doucement l’assiette pour mélanger.

Le lendemain, remplacez le milieu par cinq millilitres de DMEM-10,48 frais quelques heures après la transfection initiale, recueillez le surnageant lentiviral et passez-le à travers un filtre de 0,22 micron qui a été pré-humidifié avec du DMEM-10 pour maximiser la récupération. Le lendemain matin, répartissez 0,1 million de cellules X inactives par puits sur six plaques de puits. Dans l’après-midi, infectez les plaques en remplaçant le milieu par deux millilitres de DMEM-10 frais contenant du surnageant lentiviral et cinq à 10 microgrammes par millilitre de polybrène.

Infecter un puits témoin avec un surnageant viral produit à partir d’un vecteur lentiviral vide. Le lendemain, remplacez le support par deux millilitres de DMEM-10 contenant un milligramme par millilitre de puromycine. Utilisez la sélection pendant quatre jours.

Après quatre jours, remplacez le support par deux millilitres de DMEM-10 frais et attendez 48 à 72 heures pour la récupération. Après avoir mobilisé les cellules avec 150 microlitres de 0,05 % de trypsine EDTA, incubez-les pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Trempez les cellules avec 1,5 millilitre de DMEM-10 avant de les transférer dans des tubes coniques et de centrifuger les cellules à température ambiante à 500 fois G pendant 10 minutes.

Retirez le milieu et remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de tampon de lyse fourni dans le kit de dosage de la luciférase. Incuber la suspension à température ambiante pendant cinq minutes. Après cinq minutes, transférez la suspension sur une plaque blanche à 96 puits.

Effectuez le test en chambre noire, en suivant le protocole inclus dans le kit. Utilisez des cellules X actives comme contrôle positif et des cellules X négatives infectées par un vecteur lentiviral vide comme contrôle négatif. Les clones de fibroblastes de tendon de souris immortalisés présentent une activité luciférase Firefly positive ou négative, cohérente avec le placement du rapporteur sur le chromosome X actif ou inactif, respectivement.

L’expression de MeCP2, telle que déterminée par le Western blot, présente le modèle réciproque. Notez que l’activité de la luciférase Firefly peut être induite chez les clones négatifs avec l’administration de 5-azacitidine. S’il est présent sur le chromosome X actif, le gène de résistance à l’hygromycine confère un avantage de survie lors de la sélection de l’hygromycine, par rapport aux cellules avec le gène sur le chromosome X inactif.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir et d’effectuer un dépistage des régulateurs de l’inactivation du chromosome X à l’aide de rapporteurs insérés sélectivement sur le chromosome X inactif. Mon laboratoire a déjà réalisé des cribles de base pour les régulateurs de la chromatine chez la levure, et le succès de cette approche m’a inspiré à concevoir ce criblage pour les régulateurs de l’inactivation du chromosome X dans les cellules de mammifères. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’utilisation de petits ARN interférents, CRISPR, de petites molécules, peuvent être mises en œuvre pour aider à répondre à des questions supplémentaires concernant l’inactivation du chromosome X dans les cellules de mammifères.