태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

이 절차의 전반적인 목표는 게놈 조작을 용이하게 하기 위해 nasonia vitripennis 배아에 미세 주입을 성공적으로 수행하는 것입니다. 이 방법은 독 생산 및 성 결정과 같은 nasonia vitripennis 생물학과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하는 주요 이점은 말벌 게놈을 직접 조작할 수 있고 다양한 고급 게놈 변형을 제공한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 박사후 연구원인 Ming Li가 맡을 것입니다. 먼저 200-500명의 성체를 암컷과 수컷의 비율이 3:1로 나뉘어 벌레 기숙사 우리에 넣어 여러 개의 N.vitripennis 군체를 형성합니다. 말벌을 섭씨 25도 이상, 상대 습도 30%, 12-12도의 명/암 주기로 유지하십시오.

이틀 동안 짝짓기 한 암컷이 신선한 S.bullata 번데기와 1-10 부피에서 부피의 자당 물 용액의 작은 방울을 먹게합니다. 다음 이틀 동안 번데기를 제거하여 암컷 말벌의 산란 부위를 박탈하여 매우 육량적으로 만듭니다. S.bullota 번데기 숙주를 신선하게 유지하려면 얻은 직후 섭씨 4도에서 보관하고 필요할 때만 제거하십시오.

붉은색 번데기를 가진 어린 숙주와 더 어두운 색의 번데기를 가진 나이든 숙주를 구별하십시오. 중앙에 번데기 크기의 구멍이 뚫린 거품 마개에 새로운 S.bullata 번데기를 개별적으로 넣어 암컷 말벌이 어린 숙주에 기생할 수 있도록 합니다. 기생을 최대한 집중시키고 배아 채취를 더 쉽게 하기 위해, 둥글게 처리된 숙주의 앞쪽 끝단의 약 0.2cm만 노출시키고, 뒤쪽 끝은 더 두껍고 분화구 같은 개구부를 포함하고 있습니다.

이 배열로 숙주 번데기를 케이지에 넣고 말벌이 기생할 때까지 약 45분 동안 기다립니다. 기생한 숙주를 손으로 회수하고 잔여 말벌을 부드럽게 두드리거나 불어내어 제거합니다. 약 15분마다 새로운 숙주로 교체하여 주사 중 초기 단계의 난자를 계속 수집합니다.

해부 현미경으로 집게를 사용하여 갓 기생한 숙주의 외부 번데기의 뒤쪽 끝을 조심스럽게 벗겨내어 N.vitripennis 알을 노출시킵니다. 그런 다음 액체 접착제를 사용하여 커버 슬립을 깨끗한 유리 슬라이드에 붙여서 배아 정렬 슬라이드를 준비합니다. 끝이 가는 젖은 붓으로 숙주의 배아를 조심스럽게 털어내면서 숙주의 부드럽고 번양적인 피부가 손상되지 않도록 합니다.

그런 다음 젖은 붓으로 약 20개의 배아를 커버 슬립 옆에 바로 인접한 슬라이드에 하나씩 옮깁니다. 배아의 앞쪽 끝이 덮개 슬라이드의 가장자리에 닿도록 하여 배아의 뒤쪽 끝이 같은 방향을 가리키도록 합니다. 이를 통해 모든 배아에서 동일한 위치에 더 높은 정밀도로 주입

텍스트 프로토콜에 따라 주사 바늘을 당긴 후 약 10초 동안 섭씨 25도의 다이아몬드 연마판에 팁을 약간 터치하여 바늘 끝을 비스듬히 만듭니다. 게놈 변형 시약으로 구성된 주입 혼합물을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 마이크로로더 팁을 사용하여 주사 바늘에 2마이크로리터의 주입 혼합물을 로드합니다.

그런 다음 안감을 이룬 배아가 있는 유리 슬라이드를 복합 현미경의 스테이지에 놓습니다. 바늘을 배아의 뒤쪽 끝에 25-35도의 수직 각도로 조심스럽게 삽입하십시오. 그런 다음 주입 혼합물을 1-5 피코 리터로 주입하고 주입으로 배액이 약간 팽창하는지 확인하십시오.

막힘이 발생하면 바늘을 다시 베벨링해 보십시오. N.vitripennis 배아의 세포질은 비정상적으로 점성이 있고 끈적거리기 때문에 바늘이 자주 막힙니다. 한 번에 약 20-40개의 난자를 주입한 다음 중단합니다.

주입된 난자를 젖은 붓으로 주입된 난자를 가볍게 만져 숙주에 넣습니다. 그런 다음 새로 낳은 신선한 난자를 사용하여 계속 주입하십시오. 이상적으로 이 단계는 한 사람이 난자를 채취하여 정렬하는 동안 다른 사람은 게놈 변형 성분을 주입하고 주입된 배아를 숙주 번데기에 이식할 때 가장 효과적입니다.

마이크로 주입 후, 젖은 붓을 사용하여 이전에 쏘인 S.bullata 번데기에 한 번에 하나씩 주입된 G zero 배아를 조심스럽게 놓습니다. 숙주 번데기를 젖은 여과지와 면봉이 있는 페트리 접시에 넣고 주입된 배아가 약 하루에서 이틀 안에 부화할 때까지 섭씨 25도, 습도 약 70%에서 배양합니다. 중요한 것은 숙주에게 껍질이 벗겨진 번데기를 남길 수 있으며, N.vitripennis 알은 건조를 방지하기 위해 가습실에서 배양하는 한 정상적으로 성장한다는 것입니다.

G 제로 배아가 부화한 후 숙주 번데기를 새로운 페트리 접시로 옮기고 섭씨 25도, 습도 70%에서 부화시킵니다. 숙주 번데기를 모니터링하고 매일 G 제로 유충을 주입합니다. 숙주 번데기에서 악취가 나면 주입된 유충을 새로운 건강한 숙주 번데기로 옮깁니다.

N.vitripennis 배아에 효과적인 바늘 침투 및 미세 주입을 위해 다양한 마이크로피펫 풀러를 석영, 알루미노실리케이트 및 붕규산염을 포함한 필라멘트가 있는 여러 유형의 모세관 유리 바늘로 N.vitripennis 배아 미세주입에 효과적인 원하는 피하 주사와 같은 긴 팁을 갖도록 테스트했습니다. 여기에 사용된 게놈 변형 구성 요소는 보다 선명한 매개 게놈 편집을 위한 혼합 가이드 RNA와 cas9 단백질이었습니다. 이 실험에서는 진사 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 cas9 단백질과 함께 다양한 양으로 N.vitripennis에 주입했습니다.

이 표는 sgRNA 및 cas9 단백질의 농도 증가가 생존율 감소로 이어짐에 따라 생존율이 용량에 따라 다르다는 것을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 촉촉한 끝이 가는 붓이나 배아 송곳을 사용하여 조심스럽게 조작 또는 이식 중에 말벌 배아에 구멍을 뚫거나 건조시키지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 고급 게놈 변형을 성공적으로 수행하기 위해 말벌 배아를 효율적으로 회수, 미세 주입 및 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.