Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide

O objetivo geral deste método de bioconjugação é funcionalizar fluorescentemente partículas semelhantes a vírus contendo dissulfeto. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na reação de bioconjugação para partículas semelhantes a vírus que possuem um número limitado de resíduos de aminoácidos que podem ser funcionalizados. A principal vantagem desta técnica é que, usando uma reação, novos grupos funcionais podem ser introduzidos e fluoróforos induzidos por conjugação podem ser formados ao mesmo tempo.

Além do QBeta, acreditamos que essa reação pode ser aplicada a qualquer partícula semelhante a vírus que possua ligações dissulfeto. Antes de iniciar o procedimento de extração do bacteriófago QBeta, limpe a área da bancada com uma solução de alvejante:etanol 1:1. Em um ambiente asséptico, faça duas culturas iniciais de três mililitros adicionando colônias únicas de E.coli BL21 ao meio SOB.

Cultive as culturas em uma sala de 37 graus Celsius e 0% de umidade relativa com agitação a 250 rpm durante a noite. No dia seguinte, remova as duas culturas iniciais de três mililitros do agitador e, em um ambiente asséptico, despeje cada cultura inicial em um frasco Erlenmeyer defletor de dois litros com um litro de meio SOB fresco. Colocar os dois frascos de meios inoculados num shaker a 250 rpm na sala de 37 graus Celsius e 0% de humidade relativa.

Cultive as bactérias até atingirem uma densidade óptica de 600 nanômetros ou OD 600 de 0,9 a 1,0. Isso geralmente leva cerca de cinco horas. Quando as culturas estiverem no OD 600 desejado, use uma pipeta P1000 para adicionar um mililitro de IPTG de um molar a cada frasco para induzir a expressão de proteínas.

Deixe os frascos no shaker na sala quente durante a noite. Na manhã seguinte, remova os frascos do shaker, transfira o conteúdo de cada frasco para uma garrafa de um litro e centrifugue a 20.621 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por uma hora para colher as células. Quando a centrifugação estiver concluída, descarte o sobrenadante despejando-o em um frasco com cerca de cinco mililitros de água sanitária para matar as bactérias.

Para coletar o pellet de célula, use uma espátula para raspar o pellet de célula do fundo do frasco de centrífuga e transfira o pellet para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Para iniciar o procedimento de purificação do QBeta, ressuspenda cada pellet celular com 20 a 30 mililitros de tampão fosfato de potássio 0,1 molar, pH 7. Certifique-se de que a ressuspensão não tenha pedaços.

Lise as células usando um processador microfluidizer de acordo com o protocolo do fabricante. Lise as células pelo menos duas vezes para aumentar o rendimento das partículas. Transfira os lisados para frascos de centrífuga de 250 mililitros e centrifugue a 20.621 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por uma hora.

Medir o volume do sobrenadante em mililitros. Multiplique esse valor por 0,265 e, em seguida, adicione ao sobrenadante essa quantidade em gramas de sulfato de amônio. Adicione uma barra de agitação e mexa em uma placa de agitação a 200 rpm a quatro graus Celsius por pelo menos uma hora para precipitar a proteína.

Centrifugue em garrafas de 250 mililitros a 20.621 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por uma hora. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com cerca de 40 mililitros de tampão fosfato de potássio 0,1 molar, pH 7. Adicione à amostra bruta volumes iguais de clorofórmio: n-butanol 1: 1 e misture por vórtice por alguns segundos.

Transfira a mistura para um tubo de 38 mililitros. Centrifugue a 20.621 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por 30 minutos. Use uma pipeta para recuperar a camada aquosa superior.

Tenha cuidado para não pegar nenhuma camada semelhante a gel que se formou entre as camadas aquosa e orgânica. Em seguida, descongele seis gradientes de sacarose pré-fabricados de 5 a 40%. Coloque cerca de dois mililitros do extrato em cada gradiente.

Ultracentrífuga a 99, 582 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por 16 horas com desaceleração livre. Quando a ultracentrifugação estiver concluída, acenda uma luz de diodo emissor de luz sob cada tubo para confirmar que uma faixa azul é visível. Use uma seringa de agulha longa para recuperar essas partículas.

Ultra-pellet as partículas a 370, 541 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por 2,5 horas. O pellet resultante de partículas purificadas deve ser transparente. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com tampão fosfato de potássio 0,1 molar, pH 7.

Este esquema mostra a conjugação que será demonstrada. 10 equivalentes de Tris(2-carboxietil)fosfina ou TCEP relativos aos dissulfetos em um miligrama de QBeta são usados para reduzir todos os dissulfetos para gerar os capsídeos QBeta reduzidos à temperatura ambiente em uma hora. Pouco antes da redução de dissulfetos no QBeta, prepare uma nova solução de TCEP.

Dissolva 0,002 gramas de TCEP e um mililitro de água ultrapura para fazer uma solução estoque 100X. Adicione 200 microlitros de cinco miligramas por mililitro QBeta em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução estoque 100X TCEP ao tubo da microcentrífuga.

Incube em temperatura ambiente por uma hora. Enquanto isso, preparar a solução de dibromomaleimida polietilenoglicol ou DB-PEG para a reação posterior de religação de dissulfetos reduzidos. Dissolva 0,0017 gramas de DB-PEG em 100 microlitros de dimetilformamida.

Adicione 680 microlitros de solução de fosfato de sódio a 10 milimolares, pH 5. Em seguida, adicione o QBeta reduzido à solução de DB-PEG e observe o processo de mistura sob uma lâmpada UV portátil de 365 nanômetros. Após a mistura, uma fluorescência amarela brilhante deve ser imediatamente visível.

Deixe a reação prosseguir à temperatura ambiente em uma churrasqueira durante a noite. Na manhã seguinte, purifique a mistura de reação por filtro centrífugo usando 1X PBS a 3.283 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por 20 minutos. Por fim, monitore a conjugação por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS não redutora e eletroforese em gel de agarose nativa.

A conjugação de DB-PEG em QBeta foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS não redutora sob coloração UV e azul de Coomassie. Todas as bandas fluorescentes co-localizadas com a coloração azul de Coomassie, representando uma conjugação bem-sucedida. A integridade dos conjugados QBeta-PEG foi confirmada por eletroforese em gel de agarose nativa e microscopia eletrônica de transmissão.

A micrografia superior mostra QBeta-maleimida ou QBeta-M e a micrografia inferior mostra QBeta-PEG. A espectroscopia de fluorescência de QBeta-M e QBeta-PEG em 0,1 molar de tampão fosfato de potássio mostrou um máximo de excitação em torno de 400 nanômetros e um máximo de emissão em torno de 540 a 550 nanômetros. Quando o QBeta-PEG foi incubado com células de macrófagos de camundongo em meio DMEM livre de soro, seguido de nucleocoloração, as imagens de co-localização mostram que as partículas fluorescentes amarelas foram absorvidas pelas células e podem ser rastreadas após quatro horas de incubação.

Em contraste, as partículas semelhantes ao vírus QBeta não funcionalizadas mostram fluorescência insignificante. Este protocolo pode ajudar os pesquisadores a purificar o QBeta em quatro dias e realizar a reação de conjugação de ponte durante a noite. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a reação de conjugação funciona melhor em condições ácidas, como pH 5.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar o QBeta VLP e refazer a ponte entre as ligações dissulfeto e compostos de dibromomaleimida para fazer um VLP marcado com fluorescência. Após seu desenvolvimento, essa técnica forneceu aos pesquisadores uma alça funcional adicional que pode ser usada para funcionalizar a superfície externa do bacteriófago QBeta.