Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Wij bieden productie bloedcellen uit menselijke pluripotente stamcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we consistente en nauwkeurige opbrengsten van hemogene endotheelcellen krijgen. We verwachten dat ons platform brede toepassingen zal mogelijk maken in ziektemonitoring en screening op therapeutische verbindingen.

Deze techniek is bijzonder gunstig voor hematologie en immunologie onderzoek. De methode kan worden toegepast op genetische interventie of genbewerking van menselijke bloedcellen. Het zorgt voor eenvoudige inductie van vectoren in hemogene endotheelcellen.

Het meest cruciale punt is LM511-E8 coating voor het typen van PSC kolonies. We raden u af de coating over te slaan of te vervangen door een andere matrix. Visuele demonstraties zijn belangrijk omdat we willen laten zien hoe we de cellen kunnen spoelen met een dissociatiebuffer en hoe we platen kunnen coaten met LM511-E8.

Kweek menselijke pluripotente stamcellen of hPSC's tot tussen de 70 en 80%-confluency op een LM511-E8-gecoate zesputte plaat in mTeSR1-medium. Vier dagen voor hemogene inductie, aspirate het medium en was twee keer met PBS. Spoel de cellen met dissociatieoplossing en 15 minuten incubeer bij 37 graden Celsius.

Resuspend de cellen in PSC onderhoud medium en breng de suspensie naar een 1,5 milliliter microcentrifuge buis. Centrifugeren de cellen op 200 keer G gedurende drie minuten. Aspirate de supernatant, en resuspend de cellen in PSC beplating medium.

Plaat de PSC schorsing volgens het manuscript aanwijzingen op een microfabricage plastic vat, en incubeer 's nachts. Drie dagen voor hemogene inductie, voorzichtig pipette de PSC sferoïden in een 15 milliliter conische buis en laat ze gedurende twee minuten op kamertemperatuur te neerslaan door de zwaartekracht. Aspirate de supernatant en resuspend de sferoïden in sferoïde beplating medium.

Verdeel de suspensie in een LM511-E8 gecoate 10 centimeter kweekschotel bij een dichtheid van vier sferoïden per vierkante centimeter en incubaat gedurende drie dagen. Na drie dagen, aspirate het medium, voeg dag nul differentiatie medium, en cultuur de cellen gedurende twee dagen in een hypoxische incubator. Dan, aspirate de dag nul medium, voeg dag twee differentiatie medium, en cultuur voor nog eens twee dagen.

Twee dagen later, aspirate het medium en was de cellen twee keer met PBS. Spoel de cellen met dissociatieoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Na incubatie, dissociate de cellen door ze voorzichtig resuspending hen in een millimolar EDTA.

Breng de suspensie in een 50 milliliter conische buis, en centrifugeren de cellen op 200 keer G gedurende drie minuten. Aspirate de supernatant en resuspend de cel pellet met 300 microliters van magnetische scheiding buffer. Voeg 100 microliters cd34-positieve microbeads toe aan de cellen en meng voorzichtig door pipetten.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, gebruik dan een 40 micrometer celzeef om de suspensie te belasten en de CD34-positieve cellen te scheiden met behulp van een magnetische afscheider. Doe 0,5 milliliter van 5 microgram per milliliter fibronectine coatingoplossing in elke put van een 24 put kweekplaat en broed de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur uit. Ondertussen, centrifuge de gesorteerde CD34-positieve cellen op 200 keer G gedurende drie minuten, en resuspend de pellet in een milliliter EHT medium.

Bepaal de levensvatbare celdichtheid met een celteller en pas de celdichtheid aan op 200.000 cellen per milliliter door EHT-medium toe te voegen. Aspirate en gooi de coating oplossing uit de fibronectin gecoate putten, en afzien van 0,5 milliliter cd34-positieve cel suspensie in elke put. Broed de cellen in de hypoxische incubator gedurende een week.

Om de drijvende cellen te verzamelen, breng het kweekmedium over op een conische buis van 15 milliliter en verhoog het drie minuten lang op 200 keer G. Dan aspirate de supernatant. Om de aanhangende cellen te verzamelen, was ze twee keer met 0,5 milliliter PBS en spoel ze af met een dissocierende buffer.

Aspirate de overtollige vloeistof en inculbaat van de plaat op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Resuspend de cellen in een milliliter facs buffer, en meng de drijvende en aanhangende cellen. Centrifugeer de gemengde cellen op 200 keer G gedurende drie minuten, dan aspirate de supernatant en resuspend de cellen in 50 microliters van Facs buffer.

Verdun anti-CD34 en anti-CD45 antilichamen in 50 microliter facs buffer;voeg ze toe aan de cellen en incubeer de cellen gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker. Was vervolgens de cellen twee keer met PBS, centrifugeren op 200 keer G gedurende drie minuten na elke wasbeurt. Aspirate de supernatant en resuspend de cellen in 0,5 milliliter Facs buffer met 0,5 microgram per milliliter dappy.

Meet cd34- en CD45-expressie door middel van stroomcytometrie. Om de hematopoietische cellen te verzamelen, breng je het kweekmedium over naar een conische buis van 15 milliliter. Verzamel de resterende cellen door de put twee keer voorzichtig te spoelen met PBS.

Centrifugeer de cellen op 200 keer G gedurende drie minuten dan aanzuigen de supernatant en resuspend in een milliliter EHT medium. Na het tellen van de cellen, voeg 10.000 cellen toe aan drie milliliter methylcellulose gespreide media, aangevuld met antibiotica, en gebruik een 16-meterspuit om vijf keer te mengen. Doe de hele mediavering in elke put van een zes-put plaat.

Om de cellen vochtig te houden, voeg water of PBS toe aan de lege putten op de plaat. Broed de cellen gedurende twee weken, zorg ervoor dat de schotel niet storen als kolonies zijn bewegingsgevoelig. Tel na twee weken de kolonies onder een microscoop.

Cel morfologisch veranderen van endotheel naar hematopoietische cellen bij stimulatie met de hematopoietische cocktail. Hematopoietische celkolonies komen in de cultuur tevoorschijn. Hematopoietische voorlopercellen drukken CD34 en CD45 uit, dus flow cytometrie wordt gebruikt om de aanwezigheid van hematopoietische celkolonies te bevestigen door expressie van CD34 en CD45 te analyseren.

Een kolonie vormen eenheid test toonde de generatie van granulocyten of macrofaag kolonies uit de CD34-positieve en CD45-positieve hematopoietische voorloper cellen. Het kolonieaantal werd geschat op 38 kolonievormende eenheden per 10.000 cellen. De meest cruciale stappen zijn het tallying PSC sferoïden.

We ontdekten dat de oppervlaktemetriek de meest deterministische factor is in efficiëntie van dit protocol. Deze procedure kan worden gevolgd door off-the-shelf productie van inergical cellen zoals natuurlijk voorkomende cellen en macrofagen. Dit platform stelt onderzoekers in staat om belangrijke deterministische factoren in de menselijke hematopoietische ontwikkeling te verkennen.