Ein modifiziertes Zwei-Nieren-One-Clip-Mausmodell der Reninregulation bei Nierenarterienstenose

Das 2K1C-Mausmodell ist eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Induktion einer Nierenarterienstenose. Dieses Protokoll ist wertvoll für die Aufklärung molekularer Mechanismen, die an der Kontrolle der Reninexpression bei renaler vaskulärer Hypertonie beteiligt sind. Dieses Tiermodell ahmt die einseitige Nierenarterienstenose beim Menschen nach.

Die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit machen es zu einem guten Modell, um neue therapeutische Ziele für die Behandlung der renalen vaskulären Hypertonie zu erkennen. Diese Technik erfordert grundlegende Kenntnisse in der Durchführung von Operationen bei Mäusen. Es gibt zwei kritische Teile: die Vorbereitung der Schläuche und die Platzierung der Schläuche in der Nierenarterie.

Beides wird ausführlich beschrieben. Die Verengung der rechten Nierenarterie mit präzise geschnittenen Schläuchen ist entscheidend. Dieses Video des Verfahrens zeigt den Lernenden, wie sie den Schlauch durchschneiden, dann auf die Arterie zugreifen und sie verengen.

Beginnen Sie damit, die Schläuche für das Stenoseverfahren zu durchtrennen. Schneide ein 0,5 Millimeter langes Stück Polyurethanschlauch mit einem scharfen Skalpell ab. Machen Sie dann eine Manschette, indem Sie 0,2 Millimeter des Umfangs mit einem Längsschnitt entfernen.

Notieren Sie das Gewicht der Mäuse, das zwischen 18 und 22 Gramm liegen sollte, um eine Nierenarterienstenose mit dem Polyurethanschlauch durchzuführen. Das Gewicht der Mäuse ist entscheidend für die Durchführung der Operation. Nachdem Sie die Maus betäubt und dem Schmerzmittel verabreicht haben, legen Sie sie wieder in den Käfig, bis sie völlig bewusstlos ist.

Kneifen Sie den Zeh mit einer Pinzette zusammen, um zu überprüfen, ob die Maus vollständig betäubt und bereit für die Operation ist. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Papiertuch weg vom Operationsbereich und entfernen Sie die Haare des seitlichen Bauches mit einem elektrischen Haarschneider, der der entgegengesetzten Haarwuchsrichtung folgt. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einem sterilen Alkohol-Mullpad und tragen Sie topische Povidon-Jod-Lösung auf.

Öffnen Sie den sterilisierten Beutel mit allen chirurgischen Geräten. Wenn Sie unter dem Präpariermikroskop arbeiten, verwenden Sie eine sterile, scharfe Schere, um einen kleinen Flankenschnitt in etwa 0,5 Zentimeter Entfernung von den Wirbeln zu machen. Gehen Sie entlang der Lendenwirbel vor und machen Sie einen Einschnitt von einem Zoll.

Ziehen Sie die Haut und den Muskel zurück, um die Niere freizulegen. Reinigen und entfernen Sie dann das umgebende Fett mit Wattestäbchen, um die Nierenarterie zu isolieren. Isolieren Sie den Nierennerv mit der gekrümmten Pinzette von der Nierenarterie.

Reinige die ausgetretene Flüssigkeit in der Nähe der Nierenarterie mit einem Wattestäbchen. Legen Sie zwei Nylonnähte unter die rechte Nierenarterie, machen Sie lockere Knoten und legen Sie die Manschette um die Hauptnierenarterie in etwa gleichem Abstand zwischen der Nieren- und Aortengabelung. Schließen Sie die Manschette mit den Nylonnähten und machen Sie drei Knoten für jede Naht, um die Wahrscheinlichkeit zu vermeiden, dass die Nähte nach der Operation verloren gehen.

Schließen Sie den Schnitt im Muskel, indem Sie eine einfache durchgehende Naht anlegen und einfache unterbrochene Nähte machen, um die Haut zu schließen. Bringen Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück und lassen Sie den halben Käfig zwei bis drei Stunden lang auf einem zirkulierenden Wasserheizkissen, damit sich die Tiere von der Operation erholen können. Versorgen Sie die Tiere mit Gel-Diät, Erholungsfutter.

Verabreichen Sie am nächsten Tag ein Schmerzmittel. Wiegen Sie die Mäuse in den nächsten zwei Tagen und konsultieren Sie den Tierarzt, wenn eine Maus mehr als 20 % ihres Gewichts verliert. Untersuchen Sie die Mäuse täglich, um sie auf Rötungen, Schwellungen, Schmerzen oder Infektionen zu beurteilen.

Notieren Sie sich das Gewicht jeder Maus. Nachdem Sie das Tier eingeschläfert haben, legen Sie es in Rückenlage auf eine sterile Plattform. Sichern und verlängern Sie die Gliedmaßen, um die Bewegung einzuschränken, und besprühen Sie die Maus gründlich mit 70% Ethanol.

Mache mit einer Schere einen Schnitt in der Mittellinie und öffne den Bauch- und Brustbereich. Ziehen Sie die Haut und die Bauchfellwand zurück, legen Sie dann vorsichtig das Herz frei und punktieren Sie den rechten Ventrikel. Entferne beide Nieren mit einer Pinzette und behalte im Auge, welche Niere stenosiert wurde.

Entfernen Sie die Nierenkapseln, reinigen Sie sie von jeglichem Fett und notieren Sie das Gewicht jeder Niere separat. Schneiden Sie einen Längsschnitt beider Nieren und fixieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in 4 % PFA für die In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie. Isolieren Sie die Rinde der verbleibenden Niere und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein, um einen Western Blot durchzuführen.

Lagern Sie die Proben bis zur weiteren Analyse bei minus 80 Grad Celsius. Eine Verengung der Nierenarterie erhöht die Reninexpression in der stenosierten Niere, während sie die Expression in der kontralateralen Niere unterdrückt. Das Zwei-Nieren-Ein-Clip-Modell der Stenose induzierte die Reninexpression und erhöhte Nierenschäden.

Die Expression von Renin und Prorenin wurde mittels Immunblotting gemessen. Die Daten zeigen, dass die Renin- und Proreninexpression in der stenosierten Niere im Vergleich zu kontralateralen und Scheinnieren zunahm, was darauf hindeutet, dass die Manschette die Nierenarterie verengte und Veränderungen der Nierenperfusion verursachte. Es wurde eine Immunhistochemie durchgeführt, um die Lokalisation der Reninexpression sichtbar zu machen.

Die Bilder bestätigten eine erhöhte Expression von Renin in der abgeschnittenen Niere. Darüber hinaus wurde eine juxtaglomeruläre Zellrekrutierung entlang der afferenten Arterie in der stenosierten Niere beobachtet. Um den Effekt auf die Renin-mRNA-Expression zu untersuchen, wurde eine in situ Hybridisierung durchgeführt.

Die Daten deuten auf eine erhöhte Rekrutierung von Renin-mRNA- und JG-Zellen in der stenosierten Niere hin. Ein weiteres Merkmal der Nierenarterienstenose ist die Hochregulierung von Nierenverletzungsmarkern aufgrund von Veränderungen der Nierenperfusion, der Superoxidproduktion und des Bluthochdrucks. Daher wurde N-GAL mit Immunblotting gemessen, was zeigt, dass der Marker für akute Nierenschäden in der stenosierten Niere stark hochreguliert war.

Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, die Nylonnähte um die Nierenarterie zu legen, bevor Sie die Manschette anlegen. Es hilft, das Verfahren zu beschleunigen.