Tests de validation des inhibiteurs de l’histone d’acétyltransférase

Ces protocoles sont importants parce qu’ils fournissent des étapes détaillées pour la validation de la puissance et de la sélectivité des nouveaux inhibiteurs de la HAT, qui sont d’importants outils de recherche et des thérapeutiques potentielles. Les techniques démontrées dans cette vidéo sont faciles à exécuter et fournissent des informations sur les effets des inhibiteurs de la HAT sur l’acétylation histone mondiale et régionale. Ils permettent de comprendre la régulation épigénétique de l’expression des gènes.

L’attention portée aux détails est essentielle. Il est important de suivre les protocoles étape par étape. Commencez par préparer la réaction enzymatique dans un volume de 10 microlitres à l’intérieur d’un tube PCR de 0,2 millilitre selon les instructions manuscrites.

Puis incuber le mélange de réaction complet à 30 degrés Celsius pendant une heure dans un cycleur thermique PCR. Pendant ce temps, ajouter deux mercaptoéthanol à un rapport d’un à 10 au tampon échantillon 6X SDS. Retirez les échantillons du cycleur thermique PCR et ajoutez deux microlitres du tampon d’échantillon SDS préparé à chaque mélange de réaction.

Chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un bloc de chaleur, puis les refroidir sur la glace. Conservez les échantillons à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius ou procédez à l’électrophorésie du gel et à l’immunoblotting. Graine 100 000 cellules MCF-7 dans un millilitre de milieu de culture cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 12 puits et permettre aux cellules de croître à 80 à 90% de confluence.

Lorsque les cellules atteignent la confluence désirée, aspirer le milieu de culture cellulaire à partir des puits quatre, cinq et six, et pipette un millilitre de trois micromolaire MS275 en milieu dans chaque puits. Ensuite, aspirez le milieu de culture cellulaire à partir des puits un, deux et trois, et pipette un millilitre de DMSO dilué dans chaque puits. Retourner les cellules dans l’incubateur pendant quatre heures pour permettre l’accumulation d’histones acétylées dans les cellules exposées au MS275.

Pendant que les cellules couvent, préparez des dilutions d’A-485 dans DMSO selon les directives manuscrites. Lorsque l’incubation est terminée, aspirer le milieu des puits et ajouter les dilutions. Retournez les cellules à l’incubateur et culturez-les pendant 20 heures, puis aspirez le milieu de culture cellulaire des puits et lavez les cellules avec un millilitre de PBS.

Aspirez le PBS et ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse passive. Conservez la plaque à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Pipette 100 microlitres de chromatine sonique à partir de cellules traitées avec DMSO en deux tubes de 1,5 millilitre, puis pipette 400 microlitres de tampon de dilution ChIP à chaque tube pour porter le volume total jusqu’à 500 microlitres.

Retirez cinq microlitres de la solution de l’un des tubes et rangez-les à moins 20 degrés Celsius sous forme d’entrée DMSO. Préparer deux tubes avec de la chromatine sonique à partir de cellules traitées avec A-485 de la même manière. Utilisez une pipette pour ajouter les anticorps d’acétyl IgG et H3K27 aux échantillons DMSO et A-485.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de protéines A perles magnétiques à chaque tube, en s’assurant que les perles sont bien résuspendues. Faites pivoter les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Pelleter la protéine A perles magnétiques à l’aide d’un séparateur magnétique et enlever le supernatant sans déranger les perles.

Lavez les perles avec 500 microlitres à un millilitre de tampon de lavage à faible teneur en sel et faites-les pivoter pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Effectuez une rotation rapide vers le bas, pelleter les perles avec un séparateur magnétique et enlever le supernatant. Répétez la procédure de lavage avec tampon de lavage à haute teneur en sel, tampon de lavage au chlorure de lithium, et tampon TE.

Après le lavage avec tampon TE, retirer les échantillons d’entrée du congélateur et les mettre sur la glace. Décongeler un aliquot de proteinase K, puis pelleter les perles à l’aide d’un séparateur magnétique et enlever le tampon TE des perles. Ajouter 100 microlitres de tampon d’élitution ChIP et un microlitre de proteinase K à chaque échantillon, y compris les échantillons d’entrée et les incuber avec secouant à 62 degrés Celsius pendant deux heures à l’aide d’un thermocyclre.

Après l’incubation, chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis les refroidir à température ambiante. Pelleter les perles magnétiques à l’intérieur d’un séparateur magnétique et transférer le supernatant contenant de l’ADN dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Purifier l’ADN à l’aide d’un kit de nettoyage PCR standard et exécuter qPCR.

L’analyse in vitro d’acétyltransferase d’histone a été employée pour étudier l’effet de l’acide anacardique sur l’activité de HAT de p300 vers un substrat d’histone. Une plage de concentration a été testée et l’acétyl-CoA n’a pas été ajouté à la réaction de contrôle négative. Les résultats d’immunoblot ont été quantifiés avec ImageJ, montrant une réduction claire de l’acétyl H3K18 et de l’acétyl H3K9 à l’acide anacardique de 100 micromolaire comparé au contrôle de DMSO.

Dans l’essai d’inhibition d’inhibition d’hyper-acétylation de chromatine, traitement des cellules de MCF-7 avec HDACi MS275 acétylation fortement augmentée de l’histone 3 sur plusieurs résidus de lysine. Les niveaux basaux d’acétyl H3K18 et d’acétyl H3K27 étaient faibles, montrant les avantages d’ajouter un HDACi dans l’essai de ChHAI. L’ajout d’A-485 dans les cellules prétraitées avec MS275 atténue l’acétylation accrue d’histone à H3K18 et H3K27, mais pas H3K9.

Les résultats immunoblots ont également été quantifiés avec ImageJ. ChIP qPCR a été utilisé pour étudier les effets des inhibiteurs de la HAT sur les éléments de régulation génétique qui contrôlent l’expression oncogène. Dans l’échantillon DMSO, l’ADN précipité par l’anticorps de contrôle IgG a produit une valeur ct plus élevée que l’anticorps acétyl H3K27 dans la réaction qPCR pour le promoteur de la cycline D1, ce qui indique que le contrôle IgG non spécifique a précipité moins de complexes d’histone d’ADN que l’anticorps spécifique de l’acétyle H3K27 au promoteur.

Comparé au contrôle de DMSO, A-485 a réduit l’enrichissement d’acétyl H3K27 au promoteur de cyclin D1. Fait important, A-485 est connu pour réduire considérablement l’acétyl H3K27 dans la culture cellulaire. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que les étapes de pré-incubation des tests HAT et ChHAI in vitro sont essentielles et ne doivent pas être oubliées.

Il est également important de se rappeler d’enregistrer les échantillons d’entrée et d’éviter la perte des perles pendant chip. Après avoir effectué ces procédures, ChIP-seq est une méthode supplémentaire qui peut être exécutée pour obtenir des informations globales sur l’acétylation de l’histone à des éléments réglementaires pour l’ensemble du génome. Ces protocoles sont utiles aux scientifiques pour valider soigneusement les nouveaux inhibiteurs de la HAT et éviter de publier des sondes chimiques de mauvaise qualité dans la littérature.

Les inhibiteurs validés de la HAT peuvent subir d’autres développements en tant que thérapeutiques potentielles.