Protocolli di PCR digitale a goccia di trascrizione inversa in due fasi per il rilevamento e la quantificazione di SARS-CoV-2

Questi protocolli possono essere utilizzati per sviluppare saggi ddPCR multiplex interni per il rilevamento di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema ddPCR a due colori. Questo è utile per le persone che vogliono sviluppare i propri kit per il rilevamento di SARS-CoV-2 e altri agenti patogeni. Rispetto al gold standard RT-qPCR, RT-ddPCR può essere utilizzato per quantificare più geni SARS-CoV-2 senza la necessità di una curva standard.

Poiché la ddPCR è una tecnica emergente, la dimostrazione visiva è importante per aiutare gli utenti attuali e futuri a comprendere e sviluppare facilmente saggi multiplex per il rilevamento di SARS-CoV-2 e altri agenti patogeni. Per la sintesi del cDNA, aggiungere due microlitri di master mix di trascrizione inversa 5X, cinque microlitri del campione di RNA di interesse e tre microlitri di acqua doppia distillata priva di RNasi in un tubo PCR da 100 o 200 microlitri a un volume finale di 10 microlitri come soluzione e posizionare il tubo su ghiaccio. Una volta spenti i reagenti, caricare il campione in un termociclatore e impostare lo strumento per eseguire una trascrizione inversa a 37 gradi Celsius per 15 minuti, un'inattivazione termica della trascrizione inversa per 5 secondi a 85 gradi Celsius e una tenuta infinita finale a quattro gradi Celsius.

Prima di eseguire la PCR digitale a goccia, aggiungere 19,8 microlitri di master mix appena preparato al numero appropriato di pozzetti di una piastra PCR digitale a 96 pozzetti priva di nucleasi. Aggiungere 2,2 microlitri di cDNA a ciascun pozzetto di miscela master per un volume finale di 22 microlitri di miscela di reazione per pozzetto e sigillare la piastra con un sigillante monouso per piastre PCR. Quindi, vortice la piastra per 15-30 secondi in centrifuga per 10-15 secondi per raccogliere il contenuto del pozzo sul fondo della piastra.

Per la generazione automatica di gocce sul touchscreen del generatore automatico di gocce, fare clic su configura piastra campione e selezionare le colonne in cui si trovano i campioni sulla piastra campione. Fare clic su OK e aprire la porta automatica del generatore di gocce. Caricare le piastre di generazione del campione e delle gocce e gli altri materiali necessari per l'esperimento nelle rispettive posizioni all'interno dello strumento e chiudere la porta.

Quando il touchscreen diventa verde, indicando che tutti i materiali sono stati caricati nelle loro posizioni corrette, selezionare l'olio per le sonde e avviare la generazione di gocce. Attendere che la generazione di goccioline venga eseguita fino al completamento in base al tempo indicato sullo schermo. Quando lo schermo dice Droplets ready, aprire lo sportello per rimuovere la piastra contenente le goccioline e utilizzare un sigillante per cinque secondi a 180 gradi Celsius per sigillare la piastra con un sigillo di alluminio perforabile.

Entro 30 minuti dalla generazione delle gocce, posizionare la piastra di goccia sigillata in un termociclatore a 96 pozzetti profondi. Impostare il volume del campione su 40 microlitri e la temperatura del coperchio su 105 gradi Celsius. Quindi, la PCR amplifica le goccioline.

Per la lettura delle goccioline, dopo l'amplificazione, trasferire la piastra termica a 96 pozzetti in un lettore di gocce e aprire il software di accompagnamento su un computer collegato al lettore di gocce. Dalla modalità di configurazione, selezionare Nuovo e fare doppio clic su qualsiasi pozzo per aprire la finestra di dialogo dell'editor del pozzo. Selezionare i pozzetti da leggere e impostare l'esperimento alla quantificazione assoluta, il supermix a goccia di PCR digitale supermix per le sonde.

Impostare come destinazione un tipo al canale 1 sconosciuto e due tipi al canale 2 sconosciuto. Assegnare i nomi dei campioni in base al layout della piastra e fare clic su Applica e OK. Dopo aver salvato il modello, fare clic su Esegui.

Quando richiesto dal software, selezionare il colore FAM/HEX. Al termine dell'acquisizione dei dati, rimuovere la targhetta dal lettore. Prima di analizzare i dati, controllare i dati di tutti i pozzi per ottenere il numero totale di goccioline.

E imposta un limite per accettare un numero minimo di goccioline da contare come risultati positivi o negativi. Per l'analisi del saggio simplex e duplex, fare doppio clic sul file QLP da analizzare e selezionare Analizza. Utilizzare gli strumenti Ampiezza 1D e Soglia ampiezza 2D per distinguere tra le goccioline positive e negative per ogni pozzetto nel canale corretto, utilizzando il controllo modello di nodo e gli esempi di controllo positivo come guida.

Quindi, esporta i risultati come file CSV per ulteriori analisi. Per un test di miscelazione di sonde triplex, aprire il file QLP e selezionare i pozzetti da analizzare nella scheda Editor piastre. Impostare il tipo di esperimento per la quantificazione diretta e il test per sondare il triplice mix e immettere il nome della destinazione.

Quindi fare clic su Applica. Utilizzare gli strumenti grafici per assegnare colori specifici a diversi cluster di destinazione come indicato dalla selezione per assegnare suggerimenti popup della finestra del cluster. Quando tutti i colori target sono stati assegnati, i dati di quantificazione verranno visualizzati nella finestra dei dati del pozzo.

Esportare i dati come file CSV per l'analisi a valle. Per un test quadruplex, impostare il tipo di esperimento sulla quantificazione diretta e il test sul multiplex di ampiezza. Immettere il nome di destinazione e fare clic su Applica.

Utilizzare gli strumenti grafici per assegnare colori specifici a diversi cluster di destinazione come indicato dalla selezione per assegnare suggerimenti popup della finestra del cluster. Quando tutti i colori target sono stati assegnati, i dati di quantificazione verranno visualizzati nella finestra dei dati del pozzo. Esporta i dati come file CSV per ulteriori analisi.

Come osservato in questa analisi rappresentativa del gradiente di temperatura, temperature più elevate in ginocchio non sono state in grado di distinguere chiaramente le goccioline positive dalle goccioline negative quando è stato eseguito un test duplex. Tuttavia, con una diminuzione della temperatura inginocchiata, è stata raggiunta una separazione ottimale tra goccioline positive e negative. Utilizzando un sistema di rilevamento PCR digitale a goccia RT a due colori, è possibile rilevare uno, due, tre e quattro bersagli SARS-CoV-2 all'interno di un singolo campione.

È possibile utilizzare un esempio di controllo senza modello per individuare le goccioline negative per aiutare a impostare la soglia negativa nei saggi simplex. Nei saggi duplex, l'analisi può essere eseguita in singoli canali o nell'ampiezza 2D. Sebbene l'analisi dei dati dei saggi multiplex di ordine superiore non sia semplice, questi test sono utili, perché consentono di valutare fino a otto cluster di goccioline in saggi di mix di sonde triplex e fino a 16 cluster di goccioline per saggi basati sull'ampiezza quadruplex.

A seconda del test da sviluppare, assicurarsi che le corrette concentrazioni di primer e sonda target siano aggiunte al master mix. Utilizzando questa procedura, si possono alternare gli obiettivi per sviluppare nuovi saggi RT-ddPCR. Questi test possono essere utilizzati per diversi scopi di ricerca o per la diagnosi di malattie infettive emergenti.

Fin dal suo sviluppo, questa tecnica è stata utilizzata per la determinazione accurata delle copie di acido nucleico virale in diversi standard, il corpo umano e campioni ambientali.