Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida

A espectroscopia de pinça de força ultrarrápida é uma técnica de molécula única baseada em pinças a laser que permite investigar a quimiomecânica de motores de miosinas sob carga com a maior resolução de tempo. Esta técnica permite sondar eventos muito rápidos na produção de força, mantendo a força constante durante todas as fases da interação motora com controle total sobre a direcionalidade da força. Ao fazer os ajustes apropriados, este protocolo poderia ser facilmente aplicado a outros tipos de motores processivos, incluindo cinesinas e dineínas, para descobrir a regulação pela força.

Depois de montar um conjunto de defletores acousto-ópticos em um tradutor linear, pegue uma íris e ajuste sua abertura para se ajustar ao tamanho da abertura traseira objetiva. Substitua a objetiva pela íris centrada na caixa da objetiva rosqueada. Mova o tradutor em direção ao feixe de laser até que a parte do feixe bloqueada pelo cristal piezo seja visível após a íris e gire o tradutor ligeiramente para trás até que o feixe preencha completamente a abertura da íris.

Para preparar contas de sílica em acetato de pentila, primeiro dilua 20 microlitros de 1,2 mícron 10% de contas de sílica sólida em 1-1,5 mililitros de acetona com vórtice e 30 segundos de sonicação. Após a sonicação, recolha as contas por centrifugação e ressuscite o grânulo em 1 mililitro de acetona fresca para uma segunda lavagem. Após a segunda lavagem com acetona, lave as contas três vezes em 1 mililitro de acetato de pentila fresco por lavagem sob as mesmas condições de centrifugação e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de 1% de nitrocelulose e 900 microlitros de acetato de pentila.

Em seguida, use um pedaço de tecido de laboratório embebido em etanol puro para limpar cuidadosamente uma tampa de vidro de 24 x 24 milímetros antes de usar pinças limpas para enxaguar o vidro diretamente no etanol e permitir que a tampa seque sob um fluxo suave de nitrogênio. Vórtice e sonicate o caldo de contas de sílica preparado por 30 segundos e use um coverslip de 24 x 60 milímetros limpo a etanol para espalhar 2 microlitros de solução de grânulo de sílica na superfície do coverslip menor. Enquanto as contas estão secando, limpe uma lâmina de 26 x 76 milímetros, conforme demonstrado, e coloque duas linhas de 60-100 mícrons de espessura de 3 milímetros de dupla face coladas nas bordas longas do slide.

Usando pinças limpas, coloque a tampa revestida de contas na fita com as contas voltadas para o interior da câmara deslizante e encha a câmara com tampão fosfato de 15 milimolares e solução flutuante de esferas de poliestireno. Em seguida, sele a câmara com graxa de silício. Para calibrar a relação pixel-nanômetro da câmera de campo brilhante, adquira uma primeira imagem de um grânulo de sílica na superfície da tampa a aproximadamente 5 mícrons do centro do campo de visão.

Mova o palco para deslocar o talão de 10 mícrons em direção ao centro do campo de visão e tire uma segunda imagem. Calcule a constante de calibração da câmera medindo a distância de pixels entre duas posições do talão. Para calibrar a posição do purgador, prenda uma única partícula flutuante em um purgador e mova os defletores acousto-ópticos em passos de 0,2 mega-hertz, adquirindo uma imagem da partícula e a frequência correspondente dos defletores para cada passo.

Em seguida, repita a calibração para o segundo purgador da mesma maneira. Para calibrar a potência e a rigidez do purgador, prenda uma única partícula em cada purgador e desloque ambas as armadilhas usando os defletores acousto-ópticos em passos de 0,2 mega-hertz, registrando um movimento browniano da partícula em ambas as armadilhas com detectores de fotodiodo de quadrante e a frequência correspondente dos defletores acousto-ópticos. Obtenha constantes de calibração ajustando uma função lorentziana a um espectro de potência do movimento browniano registrado.

Para montar uma amostra para medição, adicione 1 miligrama por mililitro de BSA biotinilado a uma nova câmara com contas de sílica na superfície da tampa. Após 5 minutos, lave a câmara com tampão AB e adicione 1 miligrama por mililitro de estreptavidina à câmara. Após 5 minutos, lavar a câmara, conforme demonstrado, e adicionar 3 miosina pesada biotinilada nanomolar biotinilada em tampão M5B suplementado com 2 calmodulina micromolar.

Após 5 minutos, lavar a câmara três vezes com 1 miligrama por mililitro de BSA biotinilada suplementada com 2 calmodulinas micromolares em tampão AB e aguardar 3 minutos após a lavagem final. Fluidar a mistura de reação e selar a câmara com graxa de silício. Para medir a amostra, coloque a câmara no estágio do microscópio e mova a objetiva até que as esferas flutuantes de alfa-actinina estejam em foco.

Ligue uma armadilha e prenda um talão. Uma vez que a primeira armadilha esteja ocupada, mova o tradutor para posicionar o talão preso perto da superfície da tampa para evitar prender várias contas e prenda um talão na segunda armadilha. Deslocar a amostra através dos tradutores de longo alcance para localizar filamentos de actina de pelo menos 5 mícrons de comprimento dentro da solução.

Quando um filamento tiver sido avistado, mova a amostra para deixar uma conta presa se aproximar de uma extremidade do filamento. Uma vez que o filamento tenha sido anexado, ajuste a distância do talão ao comprimento aproximado do filamento e mova o palco para criar um fluxo na direção do grânulo não ligado. O filamento será esticado pelo fluxo e, eventualmente, se ligará ao segundo grânulo.

O complexo resultante é chamado de haltere"Para estabelecer contato actina-miosina, separe suavemente as duas armadilhas e ajuste o filamento para níveis de pretensão de até cerca de 3 piconewtons. Para sondar a rigidez do haltere, faça uma armadilha oscilar em uma onda triangular, alterando a frequência de um defletor acousto-óptico e verificando a consequente transmissão do movimento para o cordão de fuga através de seu sinal de posição. Mova o palco para posicionar o haltere na proximidade de um grânulo de sílica de pedestal e ajuste a altura do haltere para que o filamento de actina entre em contato com a superfície do grânulo de sílica.

Como observado neste registro de posição representativa, quando o motor da miosina não está interagindo com o filamento de actina, as esferas presas se movem a uma velocidade constante contra a força de arrasto viscosa da solução. Uma vez que o motor da miosina começa a interagir com o filamento, a força transportada pelo filamento em movimento é muito rapidamente transferida para a proteína, e a velocidade do sistema cai para zero, com os eventos de pisada ocorrendo sob força constante até o final da corrida. A força é comutada da direção positiva para a negativa pelo sistema de feedback, que muda a direção da força quando o talão atinge a borda da faixa de oscilação definida pelo usuário.

Quando a miosina se liga e desloca o filamento em direção à direção positiva, ela empurra o talão em direção à borda superior da faixa de oscilação. Se isso acontecer sob força auxiliar, o funcionamento da miosina será interrompido pela inversão da direção da força na borda de oscilação, limitando o comprimento da corrida à amplitude da oscilação do haltere. O alinhamento preciso do sistema óptico é necessário para alcançar a resolução espacial e temporal ideal, enquanto uma calibração precisa é necessária para determinar com precisão os valores das forças aplicadas.

Esta técnica foi adaptada para estudar a busca deslizante e direcionada de fatores de transcrição no DNA, bem como interações dinâmicas entre proteínas de mecanotransdução induzidas sobre filamentos de microtúbulos.