Chapter 15: Studying DNA and RNA

Back to chapter

15.7:

Complementary DNA

JoVE Core
Biologia Molecolare

This content is Free Access.

JoVE Core Biologia Molecolare

Complementary DNA

Video precedente
15.6: DNA Microarrays

Video successivo
15.8: FISH – Fluorescent In-situ Hybridization

Lingue

Condividere

English العربية 中文 Nederlands français Deutsch עברית italiano 日本語 한국어 português русский español Türkçe

– [Anlatıcı] Vücuttaki neredeyse tüm hücrelerin DNA’sı aynıdır ama nöronlar ve kas hücreleri gibi farklı hücre tipleri farklı genler eksprese ederler çünkü her hücrede elçi RNA, mRNA’ya belli genler transkript edilir. Laboratuvarda mRNA’lar gen ekspresyonu çalışmak için komplementer DNA, cDNA sentezinde şablon olarak kullanılabilir. Bunun yaygın bir yöntemi, hücrelerden RNA çıkarmak, sonra mRNA’yı ribozomal RNA ya da taşıyıcı RNA gibi diğer RNA tiplerinden ayırmaktır. Bu, örneği timin nükleotitleri bağlanmış bir dizi boncuk üstünden geçirerek yapılır. Bunlar, ökaryotik mRNA’nın üç ucunda bulunan bir adenin nükleotit zincirine yani Poli (A) kuyruğuna bağlanır. Diğer RNA tipleri bağlanmaz ve akıp gider. mRNA ayrıldıktan sonra Poli (T) primeri, Poli (A) kuyruğuna bağlanır, ters transkriptaz enzimlerinin mRNA’dan cDNA’nın tek bir zincirini transkripte etmesi için başlangıç noktası oluşturur. Sonra RNA’nın degradasyonu için ribonükleaz gibi kimyasallar eklenir. Sonra DNA polimeraz enzimleri cDNA’ya bir tamamlayıcı zincir sentezlemekte kullanılır. Sonuçta iki zincirli cDNA oluşur. Bu da bakteriyel veya viral vektöre sokularak moleküler biyoloji araştırmalarında kullanılabilir.

15.7:

Complementary DNA

Genel bakış

Sadece Messenger RNA'ya (mRNA) kopyalanan genler aktiftir veya eksprese edilir. Bu nedenle bilim adamları, farklı hücrelerde ve dokularda gen ekspresyonunu incelemek için mRNA'yı hücrelerden çıkarabilirler. Bilim adamı, mRNA'yı ters transkripsiyon yoluyla tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürür. mRNA intronları (kodlama dışı bölgeler) ve diğer düzenleyici sekanslar içermediğinden, cDNA (genomik DNA'nın aksine), araştırmacıların, genin kodladığı peptitin amino asit dizisini doğrudan belirlemelerini sağlar.

cDNA Sentezi

cDNA birkaç yöntemle üretilebilir, ancak ortak bir yol önce toplam RNA'yı hücrelerden çıkarmak ve daha sonra mRNA'yı daha baskın tipten izole etmektir; transfer RNA (tRNA) ve ribozomal (rRNA). Olgun ökaryotik mRNA, 3' ucuna eklenen bir poli (A) kuyruğuna (bir adenin nükleotid dizesi) sahipken diğer RNA türleri bu kuyruğa sahip değildir. Bu nedenle, bir dizi timin nükleotitleri (oligo-dTs), bir sütun veya manyetik boncuk gibi bir substrata, spesifik olarak mRNA'nın poli(A) kuyrukları baz çiftine bağlanabilir. Bir poli(A) kuyruğu olan mRNA yakalanırken, diğer RNA türleri yıkanır.

Daha sonra, retrovirüslere ait DNA polimeraz enzimi olan ters transkriptaz, mRNA'dan cDNA üretmek için kullanılır. Çoğu DNA polimeraz gibi ters transkriptaz da bir zincirin 3' ucuna nükleotit ekleyebildiği için, cDNA sentezi için bir başlangıç noktası sağlamak adına poli(A) kuyruğuna bağlanmak için bir poli(T) primeri eklenir. cDNA iplikçikleri bir saç tokası halkası şeklinde biter. RNA daha sonra alkali uygulaması veya RNaz enzimleri ile bozulur ve geriye sadece tek iplikçikli cDNA kalır.

Daha sonra genellikle ilk cDNA iplikçiklerinin saç tokası halkası veya primer olarak mRNA'nın çentikli bir parçası kullanılarak, cDNA'yı tamamlayan ikinci bir DNA iplikçiği DNA polimeraz tarafından sentezlenir.

Elde edilen çift iplikli cDNA bakteriyel veya viral vektörlere yerleştirilir ve standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak klonlanabilir. Ek araştırmalar için hücre veya dokudaki tüm mRNA'ları temsil eden bir cDNA kitaplığı da oluşturulabilir.

Suggested Reading

Pray, Leslie A. “The Biotechnology Revolution: PCR and the Use of Reverse Transcriptase to Clone Expressed Genes.” Nature Education 1, no. 1 (2008): 94. [Source]

Tags

Complementary DNA CDNA DNA Synthesis DNA Replication Reverse Transcription Genetic Material Gene Expression MRNA Protein Synthesis