微小血管内皮上で生理的E -セレクチンを介した白血球のローリングの分析

Summary

このレポートでは、生理的ずり応力下で白血球の血管内皮の相互作用を研究するための平行平板フローチャンバーの分析の視覚的描写を提供します。このメソッドは、トリガーの白血球が内皮細胞の表面上を転動すること内皮（E）-セレクチンと白血球E -セレクチンリガンドの役割を調べるために特に有用である。

Abstract

E -セレクチンは、皮膚、骨および炎症組織への白血球の循環の募集を開始役立つ微小血管内皮細胞上の1型膜タンパク質である。 E -セレクチンの発現は、皮膚や骨微小血管で構成的であり、炎症組織における微小血管でのような/ IL -1αとTNF -αなどの炎症性サイトカイン、、によって誘導される。このレクチン受容体が媒介する特徴的なローリング動作につながる循環白血球、上の炭水化物カウンター受容体のリガンドとの弱い結合相互作用を。これらの相互作用がより安定した接着剤のイベントや漏出の活動、白血球のローリング活動の特性評価および白血球E -セレクチンのリガンドの同定に先行するので、白血球の人身売買や炎症の研究で、抗炎症治療薬の開発（1-5）における主要な目標となっている。このレポートの目的は、生理的な血流の条件下で、E -セレクチン、E -セレクチンのリガンドの相互作用を研究するための最も広く使用されている技術の視覚的、包括的な説明を提供することです。ハーバード大学の皮膚病の研究センターと連携して当研究室では、デジタル視覚化し、新たな録音ソフトウェアを伴う最先端の平行平板フローチャンバー装置、NIS – Elementsを使用しています。この技術は、私たちは画面上の可視化だけでなく、ビデオフォーマットで記録圧延活動のためのリアルタイムで接着事象を分析することができます。このようなローリング周波数、せん断抵抗とテザリング/結合効率などの細胞接着のパラメータは、、Excelスプレッドシートにエクスポートして統計分析を受ける、NIS – Elementsシリーズはソフトウェアで計算されます。ここで紹介するデモでは、我々は生きてヒト骨髄内皮細胞（hBMEC）上のE -セレクチン依存性の白血球のローリング活動を調査するために平行平板フローチャンバーを採用。不死hBMEC細胞株、HBMEC – 60細胞は、私たちの内皮細胞のモデル（6）として使用されていたので、E -セレクチンリガンドのハイレベルを発現するヒト造血前駆KG1a細胞は、、、私たちの白血球のモデルとして使用された。フローチャンバーのネイティブE -セレクチンの発現を誘導し、シミュレートするには、HBMEC – 60細胞は、まずIL – 1で活性化した。私たちのビデオプレゼンテーションは、その平行板流れの解析は、プロテアーゼやグリコシダーゼを実装することによって確認できるフローチャンバーに生理的なE -セレクチンを介した白血球のローリング活動と白血球E -セレクチンリガンド（s）のその機能解析を研究するのに適した方法であることを示した消化。

Protocol

1。 hBMECの準備（HBMEC – 60細胞）フローチャンバーのためのペトリ皿に単層 4℃で一晩コート3520μg/mlのフィブロネクチンの2ミリリットルと× 10mmの組織培養皿（PBS中）° Cまたは37 ° 3時間℃での料理からフィブロネクチンソリューションを吸引し、1.5 × 10 5 HBMEC – 60細胞をHEPES＆グルタミンと[中] 199、10％FBS、10％ヒト血清、5単位/ mlヘパリン、1ng/ml組換えヒト繊維芽細胞増殖因子、1％ペニシリンを追加するストレプトマイシン]皿にし、それらを> 90％コンフルエントにまで成長することができます。 （これは2日かかります） 増殖培地を吸引し、E -セレクチンの発現をアップレギュレートするため、4-6時間のために50ng/mLのIL -1βで新鮮な培地を加​​える。細胞単層は、現在分析を圧延するための準備が整いました。 E -セレクチンの機能を遮断するには、抗ヒトE -セレクチンモアブ（クローンBBIG – E4（5D11））で37〜1時間のために20μg/mlで添加することができます℃を中和する 2。フローチャンバーのためのヒト造血前駆KG1a細胞の調製ヒト造血前駆KG1a細胞はグルタミンを含むRPMI – 1640で（1 × 10 6細胞/ ml）コンフルエントまで増殖させ、10％FBS / 1％ペニシリン-ストレプトマイシン及びフローチャンバーアッセイで使用するためにフラスコから直接ピペットでされています。 細胞数を血球計算盤を用いて計算され、その後、細胞は、10mMのHEPES（H / Hバッファ）および2mM CaCl 2をHBSSで1 × 10 6細胞/ mLで再懸濁し、 細胞をアッセイに使用するまで氷上で保存されています。 3。顕微鏡、パラレルプレートフローチャンバー及びシリンジポンプ（図1）の調製 図1平行平板フローチャンバー分析のイラスト。倒立顕微鏡、ハーバードシリンジポンプ、コンピューター/カメラと平行平板フローチャンバーは、効率的かつ再現可能な細胞解析のための最適な配置で配置されます。 倒立顕微鏡とパワーにシリンジポンプに電源と光源の電源を入れ、顕微鏡で10倍の対物を選択します。 ホルダーに50mLのコニカルチューブを配置し、H / Hおよび2mM CaCl 2を入力してください。 50mLのコニカルチューブ下の試験管ホルダーの代わりに5ミリリットルのプラスチック試験管シリンジポンプの代わりに60mlの注射器（シリンジのプランジャーと本体の両方が両方とも固定されていることを確認してください）​​。 60mlのシリンジの終わりと3方コックに5mLのシリンジを接続する3ウェイコックを取り付けます。 出力管は背面に、左と真空管に、右側に入力チューブと顕微鏡のステージ上でパラレルフローチャンバー装置（GlycoTech、（株））を置きます。 平行平板装置がステージに付着できるように真空とオープンエアのバルブに真空のチューブを取り付けます。 （このテストフローチャンバーの真空のスカートが気密の場合。）エアーバルブをオフにします。 出力チューブライン（顕微鏡の左側）3ウェイコックにして取り付けます。装置は、現在HBMEC – 60単層板上に配置するために用意されています。 顕微鏡の中央上にHBMEC – 60単層板と場所に置きます。 真空と位置単層板が中央にくるようにプレート上のフローチャンバー装置をオンにします。 優しくHBMEC – 60単層プレート上にフローチャンバー装置を下げ、フローチャンバー装置がダウンして吸引することができます。 （エスケープとこの時点で、ゴム製のガスケットを圧縮するためにチャンバに圧力を適用する必要があります空気のない音はないはずです。） 一度真空は場所の入力管は2mm CaCl 2をH / Hを含む50mLのコニカルチューブに（右上）、確立されている。 オープン3方コックで60mlの注射器と場所のポンプに流入できるように、"ポンプのモードを。" プレート上の細胞を持ち上げることなく、入力/出力ラインから空気を除去するために、吸気管を埋めるために2mL/minuteで設定されたシリンジポンプを使用して、その後すぐに液体が装置に到達する直前に、0.5ml /分に設定します。それは慎重にこのセットをプライミングし、プレートから単分子層を解除する気泡を避けるために不可欠です。 液体が60ミリリットル注射器に移動させる見られている一度、フローチャンバーとシリンジポンプをプライムし、フローチャンバーは使用できる状態になっている。このセットは、最大各セルの入力の実行のために、必要に応じ、それぞれ新たなプレートに対して繰り返されます。 4。 NISの要素を用いて白血球のローリングイベントのキャプチャデスクトップ上で開いているNISの要素。 ライブ画像のアイコンを"再生"を押します。自動露出では、今のプレートが簡単に参照できるように、フォーカシングのために重要であるだろう。 顕微鏡は、細胞単層上で適切に焦点を当てていることを確認してください。 ピントが合う、1フレーム/秒への曝露を再設定し、顕微鏡で光を調整する。画像がコンピュータに表示され、もはや低光レベルに起因する顕微鏡のファインダーの見えないはずです。光のヒストグラムは、広告することができます背景の露出を削除したり、細胞の明瞭さを向上させるためにjusted。 ムービーキャプチャに最適な画像を得るために2X2ビンまたはライブビンをクリックしてください "オープン"を選択しポート"COM3、"と、メニューバーの"マクロ"をクリックし、"ポートへの書き込み"を選択します。 （これは、シリンジポンプと調整するポートを開きます。 その後ピペット入力配管ラインの近くに5ミリリットルを試験管にKG1a細胞懸濁液1mLとは、試験管の底に入力チューブラインを配置します。 メニューバーに移動し、"キャプチャ"をクリックし、"。タイムラプス買収" 新しいメニューがポップアップします。 210秒持続するプロトコルを選択し、これはHBMEC – 60細胞に展開するためのプログラムの長さです。 （各フェーズは、画像のpumpプロトコルの間、毎秒取るようにプログラムされています。それはまた、ポンプを起動COM3ポートを介してコマンドを送信するように設定されている。）タイムラプスが中断された場合、ポンプは停止しません。自分自身で、リセットする必要があります。画像を生きるに戻るには[キャンセル]を押します。 取扱説明書によると、"プログラムモード"にシリンジポンプを設定します。 （プログラムモードでは、チャンバー内で付与されるとHBMEC – 60細胞の単層を介してKG1a細胞相互作用を決定する特定の流量（すなわち、せん断応力レベル）を手動でプログラミングすることができます。）設定をhBMECセルにローリングKG1a細胞のためにバージョン4.2のダインを以下の通り45秒/ cm 2で 、60秒は0.3ダイン/ cm 2、及び段階的に増加する毎に15秒4.2ダイン/ cmの最大2〜 チャンバー内の壁面せん断応力（W ST）は 、次式に従って算出した：W ST / mlの体積流量Qは、μは媒体の推定粘度（0.0076 P）である=6μQ/ 2 B、、 Sは、cm単位チャネルの高さ（ガスケットの厚さ）（0.03 cm）です、aとbはcm（0.5センチ）のチャネル幅です。流量はシリンジポンプのプログラムモードを使用して安定化された。 顕微鏡とコンピュータは現在、コマ撮り写真をキャプチャする準備が整いました。データの取得を開始するコンピュータ上で"実行開始"を押します。プログラムの実行中に、メディアの完全な入力/出力チューブを（に気泡がないことを確認してください）​​を維持するために、KG1a細胞を含む試験管にメディアを追加してください。 5。ターミナルのシアリル化とE -セレクチンを介したKG1aセル5の表面糖タンパク質の依存性。ローリング（図2; 5.1から5.5の動画クリップ） 上圧延KG1a細胞のアッセイHBMEC – 60細胞の非刺激。（ネガティブコントロール）KG1a細胞を調製し、上記のようなライブHBMEC – 60以外のIL -1β刺激によるオーバーフローチャンバーに注入した。 ライブ上述のようにHBMEC – 60、IL -1β刺激による上のKG1a細胞のアッセイ圧延でHBMEC – 60細胞でIL -1β。（E -セレクチン依存性の制御）前処理KG1a細胞を調製し、フローチャンバー内に注入した。 抗ヒトE -セレクチンMoAbを中和するIL -1β、その後で前処理。（E -セレクチン依存性の制御）KG1a細胞が生以上の準備と流れチャンバーに注入されたIL – HBMEC – 60細胞のローリングKG1a細胞のアッセイ上記のような抗ヒトE -セレクチンMoAbを中和すると1β-刺激HBMEC – 60前処理。 IL -1βで刺激したHBMEC – 60上を転動するシアリダーゼ消化KG1a細胞をアッセイする。 37℃1時間のためのノイラミニダーゼ0.1U/mlコレラ菌° Cで前処理したKG1a細胞は上のフローチャンバーに調製し、注入したライブIL -1β刺激による上記のようHBMEC – 60。 IL -1βで刺激したHBMEC – 60上を転動するプロテアーゼ消化KG1a細胞をアッセイする。ライブ上述のようにHBMEC – 60、IL -1β刺激による上のプロテアーゼで前処理したKG1a細胞、37 1時間のための0.2U/mlブロメライン° Cを調製し、フローチャンバー内に注入した。 6。 NIS – Elementsシリーズ – キャプチャされたKG1a細胞とKG1aセルローリングデータのグラフの解析時系列を取得した後、データを保存します。 メニューバーの"測定"タブに移動し、選択し、"しきい値を定義します。"目的の細胞が赤色に着色されるようにバーを動かす。 "すべてのイメージ"は"正常（Okay）"を選択します。全体の時間経過のシーケンスは、表示される赤い圧延細胞を変更する必要があります。 "測定"と選択して移動し、"制限を。" （制限は、ユーザーが圧延細胞を表していない閾値オブジェクトを除外することができます。これは、主にHBMEC – 60単層で作成された背景です。）圧延のセルの領域の"領域"と入力最小値と最大値を選択します。 "伸び"とは、この手順を繰り返します、"真円度を。" "尺度"を選択し、"制約を使用してバイナリを作成する"を選択し、HBMEC – 60細胞の単層上に圧延細胞のNIS – Elementsシリーズはソフトウェアの認識を最適化するために、制限値を設定します。 "測定"、"フィールドのデータを"選択し、"リセットデータを"選択に戻ります。このメニューを閉じます。 "測定"とSEに戻る"スキャンフィールド"lect。 開いている"メジャー"は、"フィールドのデータは"、"数値またはオブジェクトを"選択し、"すべてのフィールドを"選択して、データをMicrosoft Excelにエクスポートする。 次のデータ収集のためにNIS – Elementsのセルの取得を準備する"クリアデータ"を選択します。 結果： 図3。KG1a細胞上のE -セレクチン結合活性の平行平板フローチャンバーの分析。シアリダーゼまたはプロテアーゼで処理KG1a細胞は、HBMEC – 60細胞のIL -1βで前処理の単層上で効率をローリングについて分析した。実験を転がりネガティブコントロールは、HBMEC -60細胞非IL -1β-刺激または抗ヒトE -セレクチンMoAbを（5D11）の中和で治療IL -1βで刺激したHBMEC – 60細胞の上に転がりKG1a細胞を分析することによって実施された。セルローリングの周波数は、三連で行い、NIS – Elementsシリーズはソフトウェアを使用して分析した。 （*統計学的有意、P <0.001） 生理的なずり応力条件下での内皮細胞の相互作用 – このビデオベースのレポートでは、白​​血球を分析する方法の視覚的描写を提供する。白血球テザリングと転がり、そのようなインテグリンやヒアルロン酸受容体などの受容体を介して二次以上の安定した結合活性の約束のために必要な接着挙動の媒介に、E -セレクチンリガンド – 特に、我々はE -セレクチンの役割を分析した。倒立顕微鏡、ハーバードシリンジポンプ、ビデオカメラとコンピュータ/セル収集ハードウェアとの使用のために適合平行平板フローチャンバーを使用して、我々は、式中、E -セレクチンリガンド+ KG1a細胞は私たちの白血球のモデルとhBMEC細胞（HBMEC -として使用された実験を行った炎症誘発性サイトカイン、IL -1βで刺激60）が、私たちのE -セレクチン+ヒト内皮細胞のモデル（1-6）として使用した。既報の通りKG1aのセルが上を転動と比較して、我々はE -セレクチン依存的にせん断応力レベルの範囲でのIL -1βで刺激したHBMEC – 60細胞（図3）（統計的に有意な差でローリング堅牢KG1a細胞を観察非IL -1β刺激HBMEC – 60細胞）。非IL -1βで刺激したHBMEC – 60細胞やIL -1βで刺激された抗ヒトE -セレクチンモノクローナル抗体で前処理したHBEMC – 60細胞は、依存性を実証するために並行して行われた上でローリングKG1a細胞から成るネガティブコントロール、サイトカインの刺激と圧延活動のためのE -セレクチンの発現（図3）の。コレラ菌で前処理KG1a細胞のさらに、圧延解析はノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）またはブロメライン、表面のE -セレクチン糖タンパク質リガンドを消化するために知られている非特異的プロテアーゼ、とは、E -セレクチンリガンドのために末端シアル酸残基と表面の糖タンパク質の重要性を強調活動（2,3）。

Discussion

後毛細血管細静脈の表面に付与するもの同様のせん断応力条件下での内皮接着剤の相互作用 – 平行平板フローチャンバーの分析は、白血球の勉強のために使用されるin vitroアッセイ系の専門です。白血球テザリングを媒介し、活性化微小血管内皮細胞の表面上を転動でE -セレクチンリガンド – 私たちの視覚的なプレゼンテーションでここに示すように、我々はE -セレクチンの役割を調べるためにこのシステムの価値を実証。我々はまた、プロテアーゼ、グリコシダーゼとこのシステムのE -セレクチンとそのリガンドの役割を解明するためのブロッキング抗体の治療法の適用を明らかにする。これらの解析は、再現性の高いものであり、E -セレクチン研究するための実験的基礎を形成支援 – in vivoでのE -セレクチンリガンドの機能を。

サイトカイン活性化微小血管内皮細胞（hBMECまたはヒト臍帯静脈や皮膚微小血管内皮細胞）の単層で細胞接着を研究に加えて、アッセイは、組換えヒトE -セレクチンや基板などのE -セレクチン- Igのキメラ分子を精製使用して行うことができます。細胞接着用。白血球を介して仲介他の接着剤の相互作用（L -）-セレクチンと血小板（P）-セレクチンは、平行平板フローチャンバー技術を用いてアッセイすることができます。細胞単層/タンパク質基質のまたは入力白血球/セレクチン-トランスフェクタント細胞モデルの種類を変えることにより、研究者らは生理的せん断ストレス条件下でこれらの相互作用の役割を学ぶことができます。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
FBS		SIGMA	F6178-500ML
DPBS		GIBCO	14190
0.5 M EDTA		GIBCO	15575-038
1M HEPES		GIBCO	15630
Parallel-Plate Flow Chamber Kit		GlycoTech	31-001
PHD2000 Programmable Syringe Pump		Harvard Apparatus	PHD 2000
35x10mm Tissue Culture Dish		BD FALCON	353001
Fibronectin , from human plasma		SIGMA	86088-83-7 F2006-2MG
Interleukin-1_, Human; Recombinant		SIGMA	I9401-5UG
HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)		GIBCO	14170
Medium 199 w/ HEPES & Glutamine		Invitrogen	12320-039
Human Serum		Innovative Research, Inc.	IPLA-SER1
Heparin		Abraxis Pharmaceutical Products	504011
Recombinant human fibroblast growth factor		R&D Systems	233-FB
Penicillin Streptomycin		GIBCO	15140
Plastic Test tubes		BD Bioscience	352008
Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11)		R&D Systems	BBA16
Bromelain		SIGMA	B-4882