Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.
Summary
Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.
Abstract
أداة أساسية للتحقيق في دور الجينات خلال التنمية هو القدرة على تنفيذ ضربة قاضية الجينات ، overexpression والدراسات misexpression. في الزرد (<em> دانيو rerio</em>) ، microinjection من الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي والبروتينات والعقاقير [أليغنوكليوتيد] والجزيئات الصغيرة الأخرى في الجنين النامية تقدم الباحثون فحص سريعة وقوية لاستكشاف وظائف الجينات<em> في الجسم الحي</em>. في هذه المقالة عن طريق الفيديو ، وسوف نقوم شرح كيفية إعداد وmicroinject<em> في المختبر</em> توليفها EGFP مرنا ومتعدية للحظر جزئية ضد morpholino<em> pkd2</em> ، وهو الجين المرتبط راثي جسمي أمراض الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) ، إلى خلايا الأجنة 1 الزرد المرحلة. وسوف نقوم بتحليل ثم نجاح مرنا وmicroinjections morpholino من خلال التحقق من التعبير GFP وتحليل النمط الظاهري. تطبيقات واسعة من هذه التقنية تشمل الحيوانات المعدلة وراثيا وتوليد الوهم الجرثومية الخط ، ورسم خرائط مصير الخلايا وفحص الجينات. هنا نحن تصف بروتوكول للoverexpression من EGFP وضربة قاضية ل<em> pkd2</em> من جانب ومرنا morpholino حقن قليل النوكليوتيد.
Protocol
Discussion
Microinjection في الأجنة الزرد هي تقنية راسخة وقوية لاستكشاف دور جين خاص في مجال التنمية. وتشمل التطبيقات overexpression ، misexpression ، وضربة قاضية لفحوصات الجينات اهتمامك ، فضلا عن تحليل روكبي بين جينات متعددة. وقد Microinjection في الزرد المستخدمة على نطاق واسع لتوليد حيوانات معدلة وراثي?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة PKD لZS. وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لمركز يال الثروة الحيوانية (YARC) والمؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
Riferimenti
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
