Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo's

Summary

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo's voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Abstract

Zebravissen zijn al lange tijd gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van ontwikkeling studie van time-lapse beeldvorming van de levende transparante embryo. Hier beschrijven we een methode om de zebravis embryo's mount voor de lange termijn beeldvorming en demonstreren hoe de vangst van time-lapse beelden met behulp van een confocale microscoop te automatiseren. We beschrijven ook een methode om gecontroleerde, precieze schade aan de individuele vestigingen van perifere sensorische axonen in zebravis met behulp van de gerichte kracht van een femtoseconde laser gemonteerd op een twee-foton microscoop te creëren. De parameters voor succesvolle twee-foton axotomy moet worden geoptimaliseerd voor elke microscoop. We zullen aantonen twee-foton axotomy op zowel een op maat gemaakte twee-foton microscoop en een confocale Zeiss 510 / twee-foton om twee voorbeelden te geven.

Zebravis trigeminale sensorische neuronen kunnen worden gevisualiseerd in een transgene lijn te drukken GFP aangedreven door een sensorisch neuron specifieke promoter ^1. We hebben dit aangepast zebravis trigeminus model voor zintuiglijke regeneratie van axonen direct waarnemen in de levende zebravis embryo's. Embryo's worden verdoofd met tricaïne en gepositioneerd binnen een druppel agarose als het stolt. Geïmmobiliseerd embryo's worden afgesloten binnen een imaging kamer gevuld met phenylthiourea (PTU) Ringers. Wij hebben geconstateerd dat embryo's kan continu worden afgebeeld in deze kamers voor 12-48 uur. Een enkele confocale beeld wordt vervolgens opgeslagen op de gewenste plaats van axotomy te bepalen. De regio van belang is gelegen op de twee-foton microscoop door beeldvorming van de sensorische axonen onder lage, niet-beschadigende macht. Na het inzoomen op de gewenste plaats van axotomy, is de kracht verhoogd en een enkele scan van die bepaalde regio is voldoende om de axon te verbreken. Meerdere locatie time-lapse imaging wordt dan ingesteld op een confocale microscoop om direct waar te nemen axonale het herstel van een blessure.

Protocol

Deel 1: Montage zebravis embryo's voor de lange termijn imaging

1. Bereid 1% een laag gesmolten agarose oplossing voor de inbedding. Los agarose in DI-water door verhitting in de magnetron, in kleine hoeveelheid buizen en op te slaan in een verwarmings-blok bij 42 graden Celsius.
2. Selecteren van embryo's voor imaging en verwijder hun chorions door voorzichtig te trekken van de chorion uit elkaar met een tang. Embryo's kunnen worden geplaatst in een 5% PTU Ringers-oplossing te 22-24 uur na de bevruchting (HPF) om de vorming van pigment te remmen. Dit verbetert de helderheid van imaging en is essentieel voor het uitvoeren van twee-foton axotomies van sensorische axonen. Als de natuurlijke pigment is toegestaan ​​om vorm, autofluorescentie verduistert axonen op de twee-foton microscoop. Ringers oplossing voor zebravis bevat 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM _CaCl2, en 5mm HEPES, pH 7,2.
3. Verdoven embryo's door het toevoegen van ~ 0.02% tricaïne aan de PTU Ringers. Zorg ervoor dat dieren niet reageren op aanraken voordat u verder gaat.
4. Bereid de lange termijn imaging kamer door het toepassen van vacuum vet aan een kant van een glas of Teflon ring en de vaststelling van het op een glazen afdekplaat slip.
5. Overdracht een embryo in de 42 graden agarose-oplossing met een glazen pipet, zorg ervoor dat u veel van de PTU Ringers overdracht, vervolgens over het embryo met een druppel op een agarose voorbereide dekglas.
6. Positie van het embryo zoals gewenst als de agarose verhardt. Houd in gedachten dat de beeldvorming kamer wordt omgedraaid als u klaar bent, zodat het dekglas zal de bovenkant worden.
7. Als u een gemotoriseerde podium en kan afbeelding meerdere locaties tegelijk, herhaalt u de stappen 1,4-1,6 voor elke embryo.
8. Laat de agarose volledig stollen, vul dan de ring met 0,02% tricaïne PTU Ringers.
9. Van toepassing zijn vacuüm vet aan de andere kant van de ring (s), dan hebben betrekking op de ring (en) met een glasplaatje. Flip de verzegelde kamer (s) over. Deze kamers kunnen gebruikt worden voor beeldvorming over rechtop of omgekeerde microscopen.

Deel 2: Twee-foton axotomy met behulp van een custom-built twee-foton microscoop met een Chameleon Ti-saffier-laser

1. Bereid je voor op beeldvorming. Plaats de gemonteerde embryo (s) op een houder onder de microscoop. Focus op een embryo met een 40X (0.8 NA) water doelstelling. Zet de laser. Wij zijn in staat geweest om reproduceerbare visualiseren en GFP te drukken neuronen met behulp van de volgende parameters schade. Te visualiseren axonen op een niet-schadelijke power, zet laser met een golflengte van 910 nanometer (nm) en een vermogen van 30 milliwatt (mW vermeld, zijn de hoogte van vermogen bij de steekproef). Open de imaging-software. We maken gebruik van scanimage Software ontwikkeld in Karel Svoboda het laboratorium van ^{2, 3.}
2. Druk op focus naar het embryo met de twee-foton laser scan, zoekt u de axon die u wilt axotomize, en vast te leggen een beeld van dit axon. Markeer de eerste en de laatste Z-posities, het verwerven van de afbeelding en maak een maximale projectie van de Z-stacks.
3. Zoom in 70X op de tak van het axon dat u wilt axotomize en te stoppen met scannen. Verhoog de mW bij het monster op de schadelijke kracht van 180 mW, en het uitvoeren van een scan met de laser. Wij doen dit door het instellen van het aantal Z plakjes op 1 en drukken op "Grab". Dit moet voldoende zijn om de axon te verbreken. Zie de bespreking van methoden om deze procedure te optimaliseren voor uw microscoop en experimentele doel.
4. Zoom uit, verminderen het vermogen tot 30 mW en maak een opname.

Deel 3: Twee-foton axotomy op Zeiss 510 confocale / twee-foton microscoop

1. Plaats gemonteerd embryo's het podium op en breng het in beeld met behulp van een 25X objectief water of een andere geschikte doelstelling.
2. Zet de twee-foton (910 nm) en Argon (488 nm) lasers in een multi-track instelling, zodat het mogelijk is om te schakelen van de ene naar de andere. Hoewel beide lasers worden gebruikt voor het GFP te detecteren, de twee-foton emissie is gevisualiseerd met rode, en de argon laser emissie met groen om te differentiëren van de twee.
3. Gebruik de Argon laser om een ​​axon te verwonden te identificeren. Onder Z instellingen markeren de eerste en de laatste optische secties. Neem een ​​confocale beelden en een maximale uitval van de Z-stack.
4. Kies de regio van de axon te gewonden en breng deze regio in beeld. Schakel de Argon laser en zet de twee-foton laser. Scan de monster met de twee-foton met een laser intensiteit van ~ 9% transmissie om ervoor te zorgen dat de axon nog in focus.
5. Klik op de "stop"-knop, zodat de crop tool beschikbaar zal zijn. Gebruik gewas om in te zoomen op het gebied van belang. Meestal we inzoomen op ~ 70X (zoom kan worden gecontroleerd onder de "mode" tab). Onder de "kanalen" tab de intensiteit van de twee-foton van ~ 9% transmissie tot 15-20% transmissie.
6. Om sever een axon activeer de "snelle XY"-knop voor ongeveer 1 seconde en druk op de stop-knop om het overtollige schade te voorkomen. Het axon moet worden gezien als verstrooid vuil als de procedure gewerkt.
7. Om ervoor te zorgen dat de axonwas beschadigd terug te schakelen naar de 488 nm laser Argon, nog een confocale beeld, en een maximale projectie.

Deel 4: Confocale time-lapse imaging op Zeiss LSM 510

1. Bereid je voor op beeldvorming. Als u gebruik maakt van een verwarmde stadium, moet u deze in te schakelen op ten minste 30 minuten voor het opzetten van uw time-lapse film. Plaats de gemonteerde embryo (s) op een houder onder de microscoop. Focus op een embryo met de gewenste lucht doel. We maken gebruik van een 20X, 0.5 NA doelstelling. Open Zeiss LSM 510 imaging software. Zet op de juiste lasers en het opzetten van de gewenste configuratie. We zullen nu beschrijven een gedetailleerd protocol voor de lange termijn beeldvorming met Zeiss LSM Multi Tijd software. Deze methoden kunnen worden aangepast voor gebruik op uw eigen microscoop met uw imaging software.
2. Bepaal de positie en de configuratie van uw eerste embryo in de Multi Time venster. Open de scan, toneel, en Multi Time ramen. Activeer snelle scan op de scan-venster. Verplaats de etappe naar de gewenste positie XY. Markeer de eerste en laatste Z-posities in het scanvenster. Druk op stop, dan Mid, ook in het scanvenster. Wachten op de scan van de middelste Z slice te voltooien, dan drukt u op Markeer positie op het podium venster. Als u slechts beeldvorming een embryo, klik dan op de "Single Location" tab in het Multi Time venster. Klik op "Vervangen XYZ" en vervolgens op "Save Configuration". Akkoord toen hem gevraagd werd naar de vorige configuratie overschrijven. Ga verder met 4,4 stap. Als je een gemechaniseerd podium, kunt u meerdere locaties om de afbeelding meerdere embryo's. In dit geval moet u de "Multiple Locations" tab selecteren voordat het definiëren van de XYZ en de configuratie voor uw eerste locatie. Zorg er ook voor dat het pull-down menu net onder de "Multiple Locations" tab is op locatie 1, en dat het pull-down menu in de configuratie sectie zegt multi-loc 1, voordat u klikt op save configuratie.
3. Bepaal de positie en de configuratie van uw resterende embryo's in de Multi Time venster. Zoek uw volgende embryo, druk dan op een snelle scan, zet het podium in de gewenste positie XY, en markeer uw eerste en laatste Z-posities in het scanvenster. Druk op stop, dan Mid, ook in het scanvenster. Wachten op de scan van de middelste Z slice te voltooien, dan drukt u op Markeer positie op het podium venster. Klik op 'Vervang XYZ ". Controleer of de pull-down menu net onder de "Multiple Locations" tab is op locatie 2, en dat het pull-down menu in de configuratie sectie zegt multi-loc 2, klik dan op "Save Configuration". Akkoord toen hem gevraagd werd naar de vorige configuratie overschrijven. Herhaal dit proces voor de resterende embryo's.
4. Stel de parameters voor het imago van acquisitie in het Multi Loc venster. Kies de GR-GL-optie in de "Lijst van Blokken"-sectie, voer vervolgens het gewenste aantal van de groep herhalingen. Dit is het aantal keren dat de confocale zal een afbeelding te verkrijgen op elke locatie. Voer de gewenste wachten interval in het Parameters sectie. Dit is de hoeveelheid tijd vanaf de start van een imaging herhaling aan het begin van de volgende herhaling. Selecteer "ZStackXY" in de configuratie sectie. Geef je basis bestandsnaam in het onderste gedeelte. Klik op "Selecteer Afbeelding DB" en kies uw MDB. Klik op de knop "Opties". Selecteer uw MDB map om tijdelijke bestanden op te slaan. Check "houden uiteindelijke beeld open", "save uiteindelijke beeld" en "midden in het z stack". Selecteer wachten interval. Klik op OK om het venster Opties te sluiten. Klik op "Start Time". Laat Multi Tijd venster open voor de duur van imaging.
5. Analyseer uw gegevens. Als de time-lapse imaging is voltooid, zal de Multi Time software te compileren van al uw tijdelijke bestanden in een overzicht bestand voor elke locatie. Als u wilt dat de film te stoppen voordat deze is voltooid, moet u op "Finish" drukken in plaats van "Stop", zodat een samenvatting bestand wordt aangemaakt. De tijdelijke bestanden en de samenvatting bestanden automatisch moeten worden opgeslagen in de aangewezen mdb map. Vanuit het LSM software menu, klik op "3D-View", vervolgens "Projectie". Met uw samenvatting bestand dat is geselecteerd in het pull-down menu, klik op "Apply". Dit genereert een maximale projecties van de Z-stack voor elke confocale beeld. Op de LSM software menu, klik op "File" en vervolgens op "Export". Sla de maximale projecties als een reeks tif-bestanden. U kunt dan een film maken uit de serie van tif-bestanden met behulp van ImageJ of QuickTime Pro. Axonen in de LSM beelden kunnen worden getraceerd in drie dimensies met behulp van beeldanalyse software (bijv. NeuroLucida van MicroBrightfield) om gedetailleerde kwantitatieve informatie over het axon morfologie te genereren.

Deel 5: Representatieve resultaten

Een succesvol experiment zal resulteren in een nauwkeurige weergave van de cellulaire dynamisches van het axon herstel van een blessure. Uw embryo's gezond zijn na beeldvorming, met geen zichtbare degeneratie en een sterke hartslag. Het axotomy zou moeten leiden tot nauwkeurige schade, alleen verbreken de gedefinieerde tak van de axon. Er mag geen schade aan omliggende axonen en minimale cel dood. Wij geloven dat zien we de dood van een enkele epidermale cel direct op de plaats van axotomy in ~ 50% van de experimenten. Als u goed kijkt meer schade, moet u het optimaliseren van uw twee-foton-protocol, zoals beschreven in de discussie.

Discussion

Wij hebben gebruik gemaakt van de methoden beschreven om precies te axotomize perifere sensorische axonen en om direct herstel waarnemen in de levende zebravis embryo. Lange-termijn time-lapse confocale beeldvorming in de zebravis kan worden gebruikt om een groot aantal ontwikkelingsprocessen in vivo te observeren. De twee-foton beschreven axotomy procedure kan worden aangepast voor verschillende experimentele doelen. We hebben gebruik gemaakt van dezelfde algemene procedure om hele trigeminus sensorisch neuron cellichamen ablatie, door in te zoomen op de cel lichaam in plaats van op een tak van de perifere axon. Elk type cel te identificeren met fluorescentie nauwkeurig kan worden beschadigd of ablatie met de gerichte kracht van de femtoseconde laser. We waren geïnspireerd om deze technieken perfect voor de zebravis systeem door eerdere studies in verschillende andere systemen waar gepulste lasers werden gebruikt om plaatselijke schade te maken of om cellen ^4,5,6 ablatie. In controle-experimenten hebben we bevestigd dat axotomy is uiterst nauwkeurig: we hebben nog nooit beschadigd nabijgelegen axonen, zelfs als ze zijn takken van dezelfde cel, en slechts af en toe beschadigde epitheelcellen in nauw naast elkaar aan axonen. Deze specificiteit kan worden verklaard door het feit dat de intensiteit van twee-foton laser excitatie daalt kwadratisch af met de afstand tot het brandpunt ^3,7. Aangezien energie uitgestraald door de opgewonden fluorofoor draagt ​​bij aan zonbeschadigde, omliggende ongelabelde cellen kunnen worden gespaard.

Het laservermogen nodig is om een ​​axon schade kan variëren afhankelijk van de set-up van de laser, de diepte van het weefsel, en je experimentele doel. Wilt u axonen schade dieper in het embryo, zal meer kracht nodig. Het beste is om de axotomy poging tot een laag vermogen, en vervolgens geleidelijke toename van de kracht totdat u het bedrag dat de axon zal verbreken. Zodra u de juiste hoeveelheid laservermogen voor axotomy bepaald, moet u in staat om reproduceerbaar gebruik van deze laservermogen aan de lokale weefselschade veroorzaken. Als u merkt dat na verloop van tijd meer kracht nodig is om een ​​axotomy te maken, kan de laser en microscoop onderhoud nodig (bijvoorbeeld de laser kan verouderd zijn alignment). Zorg ervoor dat uw laser correct is uitgelijnd, schoon je doel, en controleer de spiegels.