Визуализация антиген Конкретные CD4 + Т-клеток с использованием МНС класс II тетрамеров
Summary
Эта процедура демонстрирует очистки и в лабораторных условиях расширения антиген специфических CD4 + Т-клеток из цельной периферической крови и их визуализации с помощью МНС класс II тетрамеров. Тетрамеров разрешение прямой визуализации Т-клеток с одной специфичности антигенов и определены MHC класса II ограничений.
Abstract
Главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II тетрамеров позволяет прямой визуализации антиген специфических CD4 + Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Этот метод основан на весьма специфическое взаимодействие между пептидными загружены МНС и соответствующих рецепторов Т-клеток. Хотя близость одного MHC / пептид молекулы мала, сшивания МНС / пептидные комплексы стрептавидином увеличивает алчность взаимодействия, что позволяет их использовать в качестве окраски реагентов. Из-за относительно низких частотах CD4 + Т-клеток (~ 1 на 300 000 для одного специфичность) данного анализа используются на этапе усиления пробирке увеличить порог обнаружения. Мононуклеаров очищаются из периферической крови от подложки Ficoll. CD4 + клетки затем разделенных негативный отбор с использованием биотинилированного коктейль антител и анти-биотин помечены магнитные шарики. Использование приверженцем клетки CD4-клеток фракция как антиген представляющих клеток, CD4 + Т-клетки разлагаются в средствах массовой информации, добавив пептидных антигенных и ИЛ-2. Расширенный клетки окрашивали соответствующего класса II тетрамер путем инкубации при температуре 37 С в течение часа, а затем окрашивали поверхности антитела, такие как анти-CD4, анти-CD3 и анти-CD25. После маркировки, клетки могут быть непосредственно анализировали с помощью проточной цитометрии. Тетрамер положительных клеток обычно составляют отдельную населения среди расширен CD4 + клеток. Тетрамер положительных клеток, как правило, CD25 + и CD4 часто высока. Потому что уровень фонового окрашивания тетрамер может меняться, положительные результаты окрашивания всегда должно быть по сравнению с окрашиванием же клетки не имеет значения тетрамер. Несколько вариаций этого основного анализа возможны. Тетрамер положительных клеток может быть отсортирован для дальнейшего фенотипического анализа, включения в ELISPOT или распространение анализов или других вторичных анализов. Несколько групп также продемонстрировали совместное окрашивания использованием тетрамеров и либо анти-цитокинов или анти-FOXP3 антител.
Protocol
Discussion
Понимание роли CD4 + Т-клеток в иммунитете является принципиально важным. Тем не менее, антиген специфических CD4 + Т-клеток может быть трудно обнаружить и изолировать с помощью традиционных методов. В отличие от MHC класса II тетрамеров позволяет прямой визуализации CD4 + Т-клеток с нужными ан?…
Acknowledgements
Мы благодарим Дика Фоли и Ли Кимбалл для их ключевых ролей в кино-и видеопродукции.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Forma | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | HyClone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning/Costar | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalgene | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo Scientific | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD pharmingen | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
Riferimenti
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
