머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포
Summary
이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.
Abstract
주요 histocompatibility 복합 (MHC) 클래스 II의 tetramers은 항원 특정 CD4의 직접적인 시각화 + 유동세포계측법에 의해 T 세포 수 있습니다. 이 방법은 펩타이드로드 MHC와 해당 T – 세포 수용체 사이의 매우 구체적인 상호 작용에 의존합니다. 하나 MHC / 펩티드 분자의 친화력이 낮은 반면, 교차 연결 streptavidin과 MHC / 펩타이드 단지하면 시약을 얼룩로서 사용할 수 있도록, 상호 작용의 욕망을 증가시킵니다. 때문에 CD4 + T 세포 (단일 특이성을위한 300,000의 ~ 1)의 상대적으로 낮은 주파수의 분석은 검출 자사의 한계를 높이기 위해 체외 증폭 단계에서을 활용합니다. Mononuclear 전지는 Ficoll의 밑받침에 의해 말초 혈액 정화됩니다. CD4 + 세포는 다음 biotinylated 항체 칵테일 및 안티 – 비오틴 분류 자석 구슬을 사용하여 부정적인 선택으로 구분됩니다. 항원은 세포, CD4 + T 세포가 antigenic의 펩타이드와 IL – 2를 추가하여 미디어 확장된다 제시로 CD4 세포 분획에서 자기편 세포를 사용합니다. 확대 세포 한 시간 동안 37 C의 잠복기와 이후 스테인드 같은 안티 – CD4, 안티 인 경우에는 3 번 CD, 및 안티 CD25와 같은 표면 항체를 사용하여 해당 클래스 II tetramer 물들일 수 있습니다. 라벨 후, 세포를 직접 유동세포계측법으로 분석하실 수 있습니다. tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 확장된 CD4 + 세포들 사이에 뚜렷한 인구를 형성합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 CD25 아르 +와 CD4 종종 높은. 배경 tetramer의 얼룩의 수준이 다를 수 있기 때문에, 긍정적인 얼룩 결과는 항상없는 tetramer와 같은 세포의 얼룩에 비해해야합니다. 이 기본 분석의 여러 변형이 가능합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 더욱 phenotypic 분석, ELISPOT 또는 확산 assays에 포함 또는 기타 보조 assays에 대한 정렬 수 있습니다. 몇몇 그룹은 또한 tetramers 및 안티 시토킨 또는 방지 FoxP3 항체 중 하나를 사용하여 공동 얼룩을 증명하고있다.
Protocol
Discussion
면역의 CD4의 역할 + T 세포를 이해하는 것이 근본적으로 중요하다. 그러나, 특정 항원 CD4 + T 세포가 감지하고 전통적인 방법을 사용하여 분리하기가 어려울 수 있습니다. 대조적으로, MHC 클래스 II의 tetramers 원하는 항원 특이성과 CD4 + T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다. 이 동영상은 고립, 정화하고, CD4 + T 세포와 tetramers를 사용하여 후속 시각화의 체외 증폭에을 보여줍니다. 클래스 II의 Tetrame…
Acknowledgements
우리는 촬영 및 비디오 제작에서 중요한 역할 딕 폴리와 레이 킴볼 감사드립니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Forma | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | HyClone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning/Costar | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalgene | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo Scientific | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD pharmingen | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
Riferimenti
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
