Detta förfarande visar på rening och in vitro utbyggnad av antigen CD4 + T-celler från hela perifert blod och visualisering med hjälp av MHC klass II tetramers. Tetramers tillåter direkt visualisering av T-celler med en enda antigenspecificitet och definieras MHC klass II begränsning.
Stora histocompatibility komplex (MHC) klass II tetramers tillåter direkt visualisering av antigen CD4 + T-celler med flödescytometri. Denna metod förlitar sig på den mycket specifika interaktionen mellan peptid laddas MHC och motsvarande T-cells receptorn. Medan affinitet av en enda MHC / peptid molekylen är låg, tvärbindande MHC / peptid komplex med streptavidin ökar aviditet av samverkan, vilket gör att de används som färgning reagenser. På grund av den relativt låga frekvenser av CD4 + T-celler (~ 1 på 300 tusen för en enda specificitet) denna analys använder en in vitro amplifieringssteg att öka sin tröskel för upptäckt. Mononukleära celler renas från perifert blod med Ficoll underlag. CD4 + celler separeras därefter genom negativa val med biotinylerad antikropp cocktail och anti-biotin märkt magnetiska kulor. Använda anhängare celler från CD4-celler delen som antigenpresenterande celler, CD4 + T-celler utvidgas i media genom att lägga till en antigen peptid och IL-2. Den utökade cellerna färgas med motsvarande klass II tetramer genom att inkubera vid 37 ° C i en timme och sedan färgas med yta antikroppar som anti-CD4, anti-CD3 och anti-CD25. Efter märkning kan cellerna direkt analyseras med flödescytometri. Den tetramer positiva celler bildar oftast en distinkt population bland de utökade CD4 + celler. Tetramer positiva celler är oftast CD25 + och ofta CD4 hög. Eftersom nivån av bakgrunden tetramer färgning kan variera, bör positiv färgning resultat alltid jämföras med färgning av samma celler med en irrelevant tetramer. Flera varianter av denna grundläggande analys är möjliga. Tetramer positiva celler kan sorteras för vidare fenotypisk analys, ingå i ELISPOT eller analyser spridning eller andra sekundära analyser. Flera grupper har också visat co-färgning hjälp tetramers och antingen mot cytokin eller anti-FOXP3 antikroppar.
Att förstå betydelsen av CD4 + T-celler i immunitet är av grundläggande betydelse. Däremot kan antigen CD4 + T-celler vara svårt att upptäcka och isolera med traditionella metoder. Däremot MHC klass II tetramers möjligt att direkt visualisering av CD4 + T-celler med önskad antigenspecificitet. Denna video visar isolering, rening, och in vitro amplifiering av CD4 + T-celler och deras efterföljande visualisering med hjälp tetramers. Klass II Tetramers är fluorescerande protein konjugat som består av lösliga…
Vi tackar Dick Foley och Leigh Kimball för nyckelroller i filma och videoproduktion.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Forma | 1200 | Or equivalent |
50 mL conical Tube | equipment | VWR | 47747-182 | Or equivalent |
1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | HyClone | SH30028.02 | Or equivalent |
Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
Pipet Aid XP | equipment | Drummond | 4-000-101 | Or equivalent |
10 mL pipet | equipment | Corning/Costar | CLS4492 | Or equivalent |
Aerosolve Canisters | equipment | Beckman | 359481 | with 50 mL inserts |
Centrifuge | equipment | Beckman | GS-6R | Or equivalent |
Transfer pipets | equipment | Samco | 202-20S | Or equivalent |
Pasteur pipets | equipment | VWR | 14672-200 | Or equivalent |
Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
Trypan blue | Reagent | Sigma | T6146 | 0.2% in PBS |
Hemocytometer | equipment | VWR | 15170-208 | |
15 mL conical tube | equipment | VWR | 05-527-90 | Or equivalent |
Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon | 352063 | |
RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalgene | 595-3320 | Or equivalent |
48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo Scientific | MCO-18AIC | Or equivalent |
20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
5 mL FACS tube | equipment | Falcon | 352008 | Polystyrene |
Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
Anti-CD3 | Reagent | BD pharmingen | 347344 | Or equivalent |
Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |