Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

Summary

GFP-fusão proteínas são amplamente utilizados para visualizar organelas por microscopia confocal. No entanto, a triagem para mutações que afetam a morfologia das organelas geralmente requer mutagênese individual e é demorado. Aqui, nós demonstramos um método para incorporar simultaneamente organela-GFP marcadores em quase 5.000 genes não-essenciais no fermento.

Abstract

Alto rendimento métodos para examinar localização de proteínas ou morfologia organela é uma ferramenta eficaz para o estudo de interações de proteínas e podem ajudar a alcançar uma compreensão abrangente de vias moleculares. Em Saccharomyces cerevisiae, com o desenvolvimento da matriz de exclusão não essenciais gene, podemos globalmente estudar a morfologia das organelas diferentes, como o retículo endoplasmático (ER) e da mitocôndria utilizando GFP (ou variante) marcadores no gene backgrounds diferentes. No entanto, os marcadores de GFP incorporando em cada mutante único individualmente é um processo trabalhoso. Aqui, descrevemos um procedimento que é utilizado rotineiramente em nosso laboratório. Usando um sistema robótico para lidar com arrays de alta densidade fermento e técnicas de seleção de drogas, podemos reduzir significativamente o tempo necessário e melhorar a reprodutibilidade. Em resumo, nós cruzamos um marcador GFP-tagged mitocondrial (Apc1-GFP) para um conjunto de alta densidade de 4.672 mutantes de deleção do gene não essencial por robótico réplica pinagem. Através da seleção diplóide, esporulação, germinação e seleção marcador dual, nós recuperamos ambos os alelos. Como resultado, cada mutante haplóide única contém Apc1 GFP-incorporados em seu locus genômica. Agora, podemos estudar a morfologia das mitocôndrias em todas fundo não essenciais mutante. Usando essa abordagem de alto rendimento, podemos convenientemente estudar e delinear os caminhos e os genes envolvidos na herança ea formação de organelas em um cenário de todo o genoma.

Protocol

Materiais e métodos: Cepas de leveduras: ACP1-GFP (GFP:: Seu): C-terminal GFP-tagging de ACP1 foi gerado por uma PCR mediada por recombinação homóloga usando pKT128 plasmídeo (contém GFP e HIS5). Transformantes positivos foram confirmados por microscopia confocal e colônia PCR. O pano de fundo a tensão foi BY7043 (MAT alfa can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) de Boone laboratório (Tong e Boone, 2006). Exclusão da Matriz Mutant (DMA) (xxx:: KanR): …

Discussion

Este método pode ajudar eficientemente incorporar um marcador mitocondrial, ACP1-GFP em várias formações mutantes. Ele se baseia na utilização de um sistema robótico, e pode facilmente adotado para uso com qualquer sistema robótico. Este procedimento pode ser usado também para incorporar outros tipos de marcadores. Por exemplo, para visualizar ER, que utilizam rotineiramente o marcador Erg11-GFP. No nosso imagens representativas, uma mutante e um tipo selvagem com o fabricante ACP1-GFP foram visualiz ed por mic…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
SGA media				The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.