أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.
Summary
وتستخدم على نطاق واسع GFP الانصهار البروتينات لتصور العضيات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ومع ذلك ، الكشف عن الطفرات التي تؤثر في التشكل من العضيات يتطلب عموما الطفرات الفردية وقتا طويلا. هنا ، علينا أن نظهر وسيلة لدمج عضية في وقت واحد ، في GFP علامات الجينات غير الضرورية في 5000 ما يقرب من الخميرة.
Abstract
الإنتاجية العالية لدراسة أساليب توطين البروتين أو التشكل عضية هو أداة فعالة لدراسة التفاعلات بين البروتينات ويمكن أن تساعد في تحقيق فهم شامل للمسارات الجزيئية. السكيراء في البيرة ، مع تطوير مجموعة الجينات الحذف غير الضرورية ، لا يمكننا على الصعيد العالمي في دراسة مورفولوجية العضيات المختلفة مثل شبكية هيولي باطني (ER) وGFP الميتوكوندريا باستخدام (أو متغير) ، علامات في الجينات خلفيات مختلفة. ومع ذلك ، تتضمن علامات GFP الطافرة في كل واحد هو عملية فردية كثيفة العمالة. هنا ، نحن وصف الإجراء الذي يستخدم عادة في المختبرات لدينا. باستخدام نظام الروبوتية للتعامل مع المصفوفات الخميرة ذات الكثافة السكانية العالية وتقنيات اختيار المخدرات ، يمكننا تقصير كبير في الوقت المطلوب وتحسين استنساخ. باختصار ، نحن نعبر علامة GFP الموسومة الميتوكوندريا (Apc1 – GFP) لمجموعة ذات الكثافة العالية من غير الضرورى 4672 المسوخ حذف الجينات التي تعلق نسخة الروبوتية. من خلال اختيار ضعفاني الإنبات ، تبوغ والمزدوجة الانتخاب ، نستعيد كل من الأليلات. نتيجة لذلك ، كل واحد يحتوي على متحولة فرداني Apc1 – GFP أدرجت في مكان به الجيني. الآن ، يمكننا دراسة مورفولوجية الميتوكوندريا في جميع الخلفية غير الضرورية متحولة. باستخدام هذا النهج الإنتاجية العالية ، ويمكننا بسهولة دراسة ورسم المسارات والجينات المشاركة في الميراث وتشكيل العضيات في وضع الخريطة الوراثية البشرية ككل.
Protocol
Discussion
هذا الأسلوب يمكن أن تساعد بشكل فعال إدراج علامة الميتوكوندريا ، Acp1 – GFP متحولة إلى خلفيات مختلفة. فهو يعتمد على استخدام نظام الروبوتية ، ويمكن اعتمادها بسهولة للاستخدام مع أي نظام الروبوتية. ويمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لإدراج أنواع أخرى من علامات. على سبيل المثال ،…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (منحة 31/C15982) ، والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية ، والمؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية صندوق التنمية ، ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية (منحة لCJR لوين) ، والكفاح من أجل البصر.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
Riferimenti
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
