שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס
Summary
GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.
Abstract
תפוקה גבוהה שיטות לבחון לוקליזציה חלבון או מורפולוגיה אברון הוא כלי יעיל לחקר אינטראקציות חלבון יכול לעזור להשיג הבנה מקיפה של מסלולים מולקולריים. ב cerevisiae Saccharomyces, עם פיתוח של מערך שאינם חיוניים המחיקה גן, אנחנו יכולים ללמוד באופן גלובלי את המורפולוגיה של אברונים שונים כמו reticulum endoplasmic (ER) ו-GFP באמצעות המיטוכונדריה (או גרסה), סמנים רקע גנטי שונה. עם זאת, סמנים GFP שילוב של מוטציה כל אחד בנפרד הוא תהליך עתיר עבודה. כאן אנו מתארים הליך המשמש באופן שגרתי במעבדה שלנו. באמצעות מערכת רובוטית להתמודד עם צפיפות גבוהה מערכי שמרים מבחר טכניקות סמים, אנחנו יכולים לקצר משמעותית את הזמן הנדרש ולשפר reproducibility. בקיצור, אנחנו חוצים סמן GFP-tagged המיטוכונדריה (Apc1-GFP) למערך צפיפות גבוהה של 4672 מוטציות מחיקה חיוניות הגן על ידי רובוטי העתק מצמיד. באמצעות בחירה דיפלואידי נביטה, נביגה ובחירת סמן כפול, אנו להתאושש גם אללים. כתוצאה מכך, כל מוטציה אחת הפלואידים מכיל Apc1-GFP שולבו ב מוקד הגנומי שלו. כעת, אנו יכולים ללמוד את המורפולוגיה של המיטוכונדריה ברקע שאינם חיוניים כל מוטציה. באמצעות גישה תפוקה גבוהה זו, אנו יכולים ללמוד בנוחות לשרטט את המסלולים ואת גנים המעורבים הירושה לבין היווצרות של האברונים בקביעת הגנום כולו.
Protocol
Discussion
שיטה זו יכולה לעזור ביעילות לשלב סמן המיטוכונדריה, Acp1-GFP לתוך רקע מוטנטים שונים. היא מסתמכת על שימוש במערכת רובוטית, והוא יכול לאמץ בקלות לשימוש עם כל מערכת רובוטית. הליך זה יכול לשמש גם עבור סוגים אחרים של שילוב סמנים. לדוגמה, כדי להמחיש ER, אנו משתמשים באופן שגרתי את הס…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (מענק 31/C15982), מכון מחקר קנדי הבריאות, קרן קנדה עבור חדשנות, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע, מייקל סמית הקרן לבריאות מחקר (מענק CJR Loewen), ולהילחם על Sight.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
Riferimenti
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
