Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.
Whole montage<em> In situ</emL'hybridation> est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution à double fluorescentes<em> In situ</emProtocole d'hybridation> pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Le protocole est une version modifiée de la norme<em> In situ</emL'hybridation> en utilisant la phosphatase alcaline et de substrats tels que NBT / BCIP et Fast-Rouge<sup> 1,2</sup>. Ce protocole utilise la norme sondes digoxygénine et marqué à la fluorescéine ainsi que l'amplification du signal tyramide (TSA)<sup> 3</sup>. Les kits disponibles dans le commerce TSA permettent flexibles expérimentale de conception telle émission de fluorescence du vert au rouge lointain peut être utilisé en combinaison avec divers colorants nucléaires, comme l'iodure de propidium, ou immunohistochimie de fluorescence pour les protéines. TSA produit un substrat réactif fluorescent rapidement covalente lie à des fragments, des résidus de tyrosine généralement, dans le voisinage immédiat de la ribosonde antisens étiquetés. L'intensité de la coloration qui en résultent sont à haute résolution dans cette localisation subcellulaire des ARNm peut être observé en utilisant la microscopie confocale à balayage laser<sup> 3,4</sup>. On peut observer des transcriptions naissant au loci chromosomiques, de distinguer la coloration nucléaire et cytoplasmique et visualiser d'autres modèles tels que la localisation corticale de l'ARNm. Studies in<em> Drosophile</em> Indiquent qu'environ 70% des ARNm présentent des modèles spécifiques de localisation subcellulaire qui souvent en corrélation avec la fonction de la protéine codée<sup> 5</sup>. Lorsqu'il est combiné avec assistée par ordinateur reconstruction des ensembles de données 3D confocale, notre protocole permet l'analyse détaillée de la distribution de l'ARNm avec des sub-cellulaire de la résolution embryons de vertébrés ensemble.
Le protocole présenté ici fonctionne bien avec des sondes qui donnent un signal propre forte après coloration pendant 30-45 minutes dans une phosphatase alcaline médiée typiques de réaction. Avant de procéder à l'fluorescente protocole d'hybridation in situ, nous examinons toujours nos sondes en utilisant la norme non fluorescent protocole (fourni dans le matériel supplémentaire avec le protocole de synthèse de la sonde). Nous avons eu moins de succès avec les fluorescents protocole d'hybridation…
Nous tenons à souligner la contribution de Dörthe Jülich, Jennifer et Andrew ronde Mara dans le développement de ce protocole. Soutien à la recherche fournis par le NICHD, l'American Cancer Society et le Mars of Dimes.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |